[发明专利]片段长度在500bp之内DNA的定量方法

说明书

技术领域

本发明涉及DNA定量应用研究领域中通过毛细管电泳检测实现不同片段DNA定量的研究领域，尤其涉及片段长度在500bp之内DNA的定量方法。

背景技术

DNA定量的常用方法有紫外光谱法（UV）、聚合酶链反应（Real time PCR）、荧光光谱法等。紫外分光光度法操作简单省时，但灵敏度低，且易受DNA样品中RNA和蛋白质的影响。Real time PCR定量灵敏度较高，但对序列依赖性强，且数据处理繁琐费时。荧光定量操作简单，灵敏度较高对DNA的选择性也较好。DNA定性方法最常用的就是平板凝胶电泳和毛细管电泳。平板凝胶电泳存在灵敏度低、易产生假阳性、高成本和分析时间冗长、毒性大等缺点，不适合用于大量临床样品分析。目前，一些荧光测定DNA的方法所用的仪器均存在样品消耗量较大、仪器价格昂贵、分析时间长、不易自动化的缺陷。但当毛细管电泳结合激光诱导荧光（CE-LIF）来检测DNA，就可以克服上述这些定量中的问题，采用毛细管电泳结合激光诱导荧光（CE-LIF）来定量DNA是有据可依的。

毛细管电泳结合激光诱导荧光（CE-LIF）检测具有灵敏度高、样品消耗量小、分析时间短、毒性小、易自动化等优点。近年来，毛细管电泳结合激光诱导荧光（CE-LIF）在检测DNA方面显示了很强的优越性。在1985~2012年中国专利数据库中记载了申请号为200610038026.0的中国专利《人血浆DNA定量分析方法》、申请号为201010283094.X的中国专利《基于核酸内切酶消化的甲基化DNA定量检测方法》、申请号为201110115570.1的中国专利《一种通过DNA定量测定蓝藻胞内藻毒含量的方法》、申请号为20111068228.0的中国专利《一种快速测定细胞核内DNA含量的方法》、申请号为201110099204.1的中国专利《探针法检测CHO细胞DNA含量的方法》，上述专利仅公开采用两重荧光定量基因扩增，提取已知外源性阳性质粒回收效率，用计算公式计算得知血浆DNA的量。

采用荧光分光光度计测定荧光强度，并计算甲基化DNA含量，采用检测藻细胞中的DNA含量，根据DNA含量与胞内藻毒素产量之间的相关性关系进行计算，来定量藻毒素的定量，采用计算机图像分析系统进行扫描分析，计算出标准细胞DNA含量，再根据细胞DNA含量计算出玻片上细胞的DNA含量，采用实时荧光定量PCR，根据所获得的标准曲线，计算得到待检样本中CHO细胞DNA的量。上述方法仍然无法快速定量DNA。而通过毛细管电泳结合激光诱导荧光用于定量不同片段大小DNA的方法却未见文献报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种速度快、灵敏度高的片段长度在500bp之内DNA的定量方法。

为解决上述问题，本发明所述的片段长度在500bp之内DNA的定量方法，包括以下步骤：

⑴毛细管柱内壁修饰: 将毛细管内壁用0.2mol/L NaOH清洗后，分别依次将γ-甲基丙烯酰基-三（甲氧基）硅烷（MAPS）/甲醇溶液和质量浓度为3.4%的丙烯酰胺单体溶液充填入毛细管柱内进行共价涂层修饰；

⑵配制含TBE的筛分介质：将筛分介质聚环氧乙烷加入1×TBE缓冲液中，使最终溶液质量浓度为3.0%、pH值为8.2后，搅拌至溶液澄清为止，该澄清溶液用0.45um水系微孔滤膜过滤后，即得含TBE的筛分介质；

⑶荧光染料的加入量确定：在1~15μL、浓度为1/1000的荧光染料SYBR Green Ⅰ中加入浓度为0.5ug/ml的标准品pUC19DNA/MspⅠ(HpaⅡ) Marker 15μL混匀，再加入去离子水使总体积为30μL，最终使其荧光染料的浓度为1/30000~1/2000；在分离电压为15kv、温度为15℃的条件下采用负极-10KV电动进样10s的方式进行电泳分离，根据所述pUC19DNA/MspⅠ(HpaⅡ) Marker电泳图中26~501bp片段大部分的峰面积为最大值时所对应的加入量确定为荧光染料加入量；