[发明专利]增强腺相关病毒载体功能的方法

说明书

本申请是国际申请PCT/US2006/013375，国际申请日2006年4月7日，中国国家阶段申请号200680010566.6，名称“增强腺相关病毒载体功能的方法”的发明专利申请的分案申请。 

发明背景 

腺相关病毒(AAV)是细小病毒科(Parvovirus)家族的一个成员，它是小的无包膜、二十面体病毒，具有4.7千碱基(kb)到6kb的单链线性DNA基因组。由于该病毒是作为纯化的腺病毒原种的污染物被发现的，AAV指定为依赖病毒属(Dependovirus)。AAV的生命周期包括潜伏期(AAV基因组在感染后位点特异性整合入宿主染色体)，感染期(腺病毒或单纯疱疹病毒感染后，整合的基因组接着得到拯救、复制并包装入感染的病毒)。非致病性、宽宿主范围(包括非分裂细胞)感染性以及潜在的位点特异性染色体整合的特性使得AAV成为用于基因转移的有吸引力的工具。 

已经描述AAV载体用于治疗用和免疫原性分子的运载工具。迄今为止，已从人或非人灵长类(NHP)中分离了几种表征良好的不同AAV。 

最近，研究者描述了不同序列的大量AAV[G.Gao等人，Proc Natl Acad Sci USA，100(10):6081-6086(2003年5月13日)；US-2003-0138772-A1(2003年7月24日)]，并且将这些AAV表征为不同的血清型和分化体[G.Gao等人，J.Virol.，78(12):6381-6388(2004年6月)；国际专利公开号WO 2005/033321]。已报道不同的AAV表现出不同的转染效率，也表现出对不同细胞或组织的趋性。 

想要得到用于向不同细胞类型递送异源分子的基于AAV的构建体。 

发明概述 

本发明提供了一种用于改善无功能和/或功能弱的AAV载体的方法。 

一方面，该方法提供了一种在选定的腺相关病毒(AAV)序列中校正单现突变(singleton)以提高选定AAV的包装产量、转导效率和/或基因转移效率的方法。该方法包括改变亲代AAV衣壳中的一个或多个单现突变使所述单现突变与用来比对的功能性AAV衣壳序列中对应位点的氨基酸相一致。 

另一方面，本发明提供了经修正的AAV序列，即除去一个或多个单现突变 的序列。 

又一方面，本发明提供了具有根据本发明修正的AAV衣壳的AAV载体。 

下述发明详述容易地表现出本发明的其他方面和优点。 

附图简述 

图1显示经单现突变校正的AAV载体的体外293转导。在载体名称之后标明了单现突变的校正(如果存在的话)，数字表示突变的数目。 

图2A-2C显示用293细胞测定的AAV载体在感染复数范围为10¹到10⁴的滴度，其中，图2A比较亲代rh.8和经单现突变校正的rh.8(rh.8R)，图2B比较亲代rh.37和经修正的rh.37，图2C比较AAV2和AAV8。作为对照，还给出了AAV2和AAV2/8 eGFP表达载体的相似滴定的结果。Y轴表示以流式细胞计数法测定的eGFP阳性细胞百分比(%)。 

图3是AAV序列的系统发生树，显示了它们的系统发生关系和所属分化体 

图4A-4L是AAV2[SEQ ID NO:7]、cy.5[SEQ ID NO:8]、rh.10[SEQ ID NO:9]、rh.13[SEQ ID NO:10]、AAV1[SEQ ID NO:11]、AAV3[SEQ ID NO:12]、AAV6[SEQ ID NO:13]、AAV7[SEQ ID NO:14]、AAV8[SEQ ID NO:15]、hu.13[SEQ ID NO:16]、hu.26[SEQ ID NO:17]、hu.37[SEQ ID NO:18]、hu.53[SEQ ID NO:19]、rh.39[SEQ ID NO:20]、rh.43[SEQ ID NO:21]和rh.46[SEQ ID NO:22]的衣壳蛋白(vp1)核酸序列的比对。