[发明专利]检测细菌总数的试剂盒和检测方法

说明书

技术领域

本发明提供了一种利用三磷酸腺苷（ATP）生物发光原理简便、快速、准确地检测细菌总数的试剂盒和检测方法，属于微生物检测技术领域。

背景技术

简便、快速、准确地检测样本或环境中的细菌总数在诸如临床诊断、食品安全等多个领域都广泛受到关注。特别地，对于当今备受热议的食品安全领域而言，细菌总数是食品安全标准中规定的重要检测指标，主要用来判断食品被微生物污染的程度。然而，目前国家标准方法检测时长48小时，这样就给食品卫生检测和生产环境实时监测带来一定的困难。随着食品行业对食品的卫生质量要求越来越严格，迫切需要一种能简便、快速、准确地检测食品及其环境、设备清洁度的方法及相应的试剂盒。

ATP生物发光法是现阶段研究和应用较多的一种检测细菌总数的方法。该方法因无需进行微生物培养，且操作简便、快速、高灵敏度等特点，近年备受关注。

ATP是一种高能磷酸化合物，由一分子腺嘌呤、一分子核糖和三个相连的磷酸基团构成。在化学反应中，ATP主要通过释放磷酸基团从而达到释放能量的目的。使用ATP生物荧光检测法，其化学反应的结果是把化学能转换为光能，具体表示如下：上述反应表明，在有足量荧光素和氧的条件下，ATP的数量与光信号的强弱成正比。这种光信号可由微量荧光检测仪检测，每个发光值都会对应相应的细菌总数，从而达到了即时检测细菌总数的目的。

利用上述反应原理，国内外已经推出了多种ATP检测试剂，但这些试剂由于保质期短、配制复杂和/或裂解不完全，应用并不十分广泛。因此，有必要开发一种能够利用ATP生物发光原理简便、快速、准确地检测样本中的细菌总数且配制简便、保质期长的试剂盒。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用ATP生物发光原理检测样本中的细菌总数的试剂盒以及利用该试剂盒检测样本中细菌总数的方法。本发明的试剂盒配制简便、保质期长，且能够简便、快速、准确地检测样本中的细菌总数，从而实现细菌总数的简便、快速、准确检测。

一方面，本发明提供了细菌总数检测试剂盒，其包括：

终浓度0.1%～0.2%的TritonX-100水溶液，作为体细胞三磷酸腺苷（ATP）释放试剂；

终浓度5mmol/L～10mmol/L的十六烷基三甲基溴化铵（CTMAB）水溶液，作为细菌细胞裂解试剂；

终浓度5mmol/L～10mmol/L的β-环糊精水溶液，作为细菌细胞裂解试剂的中和剂；

和包含荧光素酶和荧光素的发光试剂。

在一个实施方案中，所述荧光素酶的浓度为0.05～0.075g/L，荧光素的浓度为0.07～0.25g/L。

在一个实施方案中，所述发光试剂还包含镁离子，作为稳定剂的乙二铵四乙酸（EDTA），作为抗氧化剂的二硫苏糖醇（DDT），作为酶稳定剂的牛血清白蛋白（BSA）和作为缓冲剂的三（羟甲基）氨基甲烷（Tris）。

在一个实施方案中，所述镁离子的浓度为10mmol/L，EDTA的浓度为1mmol/L，DDT的浓度为1mmol/L，BSA的浓度为100μg/L，Tris的浓度为25mmol/L，pH为7.8。

在一个实施方案中，本发明提供了细菌总数检测试剂盒，其包括：

终浓度0.1%或0.2%的TritonX-100水溶液，作为体细胞ATP释放试剂；

终浓度5mmol/L或10mmol/L的CTMAB水溶液，作为细菌细胞裂解试剂；

终浓度5mmol/L或10mmol/L的β-环糊精水溶液，作为细菌细胞裂解试剂的中和剂；和

发光试剂，包含0.075g/L荧光素酶、0.25g/L荧光素、1mmol/L EDTA、10mmol/L MgSO₄、1mmol/L DDT，100μg/L BSA和25mmol/L Tris，pH为7.8。

另一方面，本发明提供了利用所述试剂盒检测细菌总数的方法，其中，所述方法包括将待检测样本和细菌标准品分别放入不同的过滤比色杯中，加入所述体细胞ATP释放试剂作用50秒～80秒（例如60秒、70秒），抽滤除去液体，然后加入所述细菌细胞裂解试剂作用10秒～20秒，随后依次加入所述中和剂和发光试剂，并利用荧光检测器（如分光光度计）检测荧光信号。

在一个实施方式中，所述过滤比色杯的滤膜为0.22μm。

在一个实施方式中，所述方法包括利用细菌标准品的荧光信号计算待测样本中的细菌数的步骤。

在一个实施方式中。所述细菌标准品为大肠杆菌水溶液。