[发明专利]急性B淋巴细胞白血病启动细胞表型分类试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明属于细胞表型确认过程中的专用试剂盒结构设计，具体涉及一种检测急性B淋巴细胞白血病启动细胞表型分类的试剂盒及其应用。

背景技术

急性淋巴细胞白血病（Acute lymphoblastic leukemia，ALL）是全球高发的血液系统恶性肿瘤之一，是严重危害人民身体健康、尤其是儿童和青壮年人群的重大疾病，提高其根治率具有重大意义。近半个世纪以来治疗方案的优化已使儿童ALL的诱导缓解率和长期生存率得到了显著提高，5年无病生存率（Disease-Free Survival，简称DFS）已达到70-80%，但是成人ALL的5年DFS始终在30%左右徘徊。复发是ALL患者治疗失败的主要原因，是影响ALL患者长期生存的重要问题。复发后的长期化疗及造血干细胞移植等巨额的医疗费用给社会和家庭都造成了极其沉重的精神和经济负担，是对医疗行业和国家医疗保障制度的严峻考验。因此，积极探索易于检测并且特异性表达的新标记用于ALL复发预测，对于改善ALL患者的长期预后具有重要意义。

越来越多的实验证据表明白血病干细胞（leukemia stem cells，简称LSCs）是白血病启动、复发与耐药的根源。那些能够在免疫缺陷小鼠体内长期重建白血病并且具有自我更新能力的细胞称为白血病启动细胞（leukemia initiating cells，LICs），基本等同于LSCs。在前期工作中，利用新生期NOD/SCID/IL2rγ^null小鼠异种移植模型首次鉴定出CD34⁺CD19⁺细胞为急性B淋巴细胞白血病（简称B-ALL）患者的LICs。但是，为了将B-ALL患者的LICs与正常B祖细胞鉴定开来并进行分类，找到LICs特异性表面标记及其处理步骤与方法，目前国内外尚未见报道。因此，这是一个关键的课题，涉及到急性B淋巴细胞白血病临床治疗方案的制定是否更加科学、高效与个体化。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种对急性B淋巴细胞白血病启动细胞表型分类试剂盒产品的结构设计及其操作步骤，利用该试剂盒中的专用试剂和配套的使用方法、并借助七色流式细胞仪的辅助，可以快速、准确地测定LICs表型，将对急性B淋巴细胞白血病患者LICs表型的快速、准确分类以及对患者的预后判断和临床治疗方案的制定具有重要的指导意义。

为了解决上述技术问题，本发明采取的技术方案1是：

一种急性B淋巴细胞白血病启动细胞表型分类试剂盒，与七色流式细胞仪组成白血病启动细胞表型分类装备，该试剂盒的结构中配置了下述单克隆抗体试剂：CD58、CD10、CD34、CD19、CD45和CD38。

所述单克隆抗体试剂CD58、CD10、CD34、CD19、CD45和CD38依前后排列顺序依次进行特异性荧光素标记为：FITC、PE、PerCP、APC-Cy7、Pacific Blue和APC。

本发明还提供了一种借助于上述试剂盒和七色流式细胞仪对急性B淋巴细胞白血病启动细胞进行表型分类的方法，该方法中包括下述步骤：

步骤一、试剂配制

1.1、配制pH为7.2~7.4的10×PBS缓冲液，并稀释10倍成为1×PBS缓冲液，

1.2、取溶红细胞液，并用1×PBS缓冲液稀释10倍，

1.3、取小牛血清加入至1×PBS缓冲液中，制备含0.5wt.%~2wt.%血清的PBS；

步骤二、对骨髓标本进行荧光标记，制备测试标本

2.1在同一专用试管中，依次分别加入荧光标记的单克隆抗体如下：3μL CD58FITC，10μL CD10PE，1μL CD34 PerCP， 2μLCD38APC，5μL CD19APC-Cy7和1.3μL CD45Pacific Blue；然后再加入100μL骨髓标本，混匀，室温避光放置15分钟孵育，

2.2、加入步骤1.2中稀释后的溶红细胞液2mL，混匀后避光，室温放置 8分钟，溶解红细胞，

2.3、1500转/分离心5分钟，弃上清液，加入步骤1.3中2mL含0.5wt.%~2wt.%血清的PBS，混匀，

2.4、1500转/分离心5分钟，弃上清液，加入步骤1.1中0.3mL1× PBS缓冲液，混匀，制成待测标本；