[发明专利]一种单葡萄糖醛酸甘草次酸的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种高纯度单葡萄糖醛酸甘草次酸（GAMG）的制备方法。

背景技术

甘草是我国一种传统的中草药，其主要成份甘草酸具有抗炎症、抗病毒、抗肿瘤、抗过敏等作用，而且它是一种甜味剂，甜度约是蔗糖的170倍。单葡萄糖醛酸甘草次酸（glycyrrhetic acid 3-O-mono-β-D-glucuronide, GAMG）作为甘草酸的衍生物，两者具有相似的生物活性，其在抗炎和抗过敏活性上等同或超过甘草酸，而且具有显著的抗癌作用。GAMG是一种新型的天然甜味剂，甜度约是GL的5倍。因此，GAMG具有重要的研究价值。因此，寻找提取纯化GAMG的最佳工艺条件，工艺流程成为GAMG利用要解决的首要问题。

发明内容

本发明的目的在于针对目前在制备GAMG过程中所存在的工艺复杂以及纯度不高的问题，提供一种制备高纯度GAMG的新方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种GAMG的制备方法，以甘草为原料，采用高效液相色谱法制备高纯度GAMG，它包括以下步骤：

（1）取新鲜甘草，以体积比1:10与含0.5%氨水的70%乙醇水溶液混合后，超声波萃取1~2h后，离心取上清液；

（2）将上清液用盐酸调pH至3~4，酸沉过夜，离心取沉淀，用去离子水洗2-3次后，至于真空干燥箱中干燥，得GAMG粗品；

（3）取GAMG粗品粉末，加水溶解并用氨水调至pH8-9，待完全溶解后，加入等体积的有机溶剂萃取2-3次后，取水层；

（4）将水层pH调回至5，采用C18反相硅胶色谱柱，甲醇和水作为流动相，等度/梯度洗脱，经过半制备型液相色谱仪进行最后一步的分离纯化后，收集到的GAMG的纯度高于99.5%。

本发明的有益效果是可选用新鲜甘草或者甘草粗提物来制备GAMG，过程简单、易控制，工艺技术简化，生产成本低，该半制备的色谱条件可同比放大，适用于工业级生物医药用液相制备色谱装置，以实现高纯度GAMG的工业化生产。高效液相色谱测定中，总杂质峰小于0.45%，单一杂质峰不超过0.2%。此产品完全符合欧洲药典标准。

附图说明

图1是上样5mg纯化GAMG的色谱图

图2是上样10mg纯化GAMG的色谱图

图3是上样2mg纯化GAMG的色谱图

图4是GAMG纯品液相色谱法测定图

具体实施方式

实施例1

1.取1kg已粉碎后的新鲜甘草粉末与10倍体积含0.5%氨水的70%乙醇水溶液混合后，超声波萃取1h后，离心取上清液；

2. 用浓盐酸调节上清液pH至3~4，酸沉过夜，离心取沉淀，用去离子水洗2-3次后，至于真空干燥箱中干燥，得GAMG粗品；

3.称取GAMG 粗品0.5g，加入50ml水中，用氨水调pH至8后，待GAMG粗品完全溶解后，加入等体积的乙酸乙酯萃取三次，取水层；

4.将水层pH调回至5，采用半制备型液相色谱仪进行最后一步的分离纯化，色谱柱尺寸为Φ10×250mm，C18反相硅胶填料为江苏汉邦科技有限公司产品，粒径为10um，上样量5mg，流动相为纯甲醇-水溶液，梯度度洗脱条件为，0~25min，甲醇65%~80%；25~50min，甲醇80%~80%，流速4ml/min，柱温为20℃，紫外检测波长为230nm，收集保留时间在36.5~38.5min的馏分。经HPLC分析纯度≥99.6%。

实施例2

1.取1kg已粉碎后的新鲜甘草粉末与10倍体积含0.5%氨水的70%乙醇水溶液混合后，超声波萃取1.5h后，离心取上清液；

2. 用浓盐酸调节上清液pH至3~4，酸沉过夜，离心取沉淀，用去离子水洗2-3次后，至于真空干燥箱中干燥，得GAMG粗品；

3.称取GAMG粗品0.5g，加入50ml水中，用氨水调pH至9后，待GAMG粗品完全溶解后，加入等体积的丙酮萃取三次，取水层；

4.将水层pH调回至5，采用半制备型液相色谱仪进行最后一步的分离纯化，色谱柱尺寸为Φ10×250mm，C18反相硅胶填料为江苏汉邦科技有限公司产品，粒径为5um，上样量10mg，流动相为纯甲醇-水溶液，梯度度洗脱条件为，0~20min，甲醇60%~75%；20~35min，甲醇75%~85%，流速4ml/min，柱温为25℃，紫外检测波长为230nm，收集保留时间在36~40min的馏分，经HPLC分析纯度≥99.5%。

实施例3