[发明专利]多残留金标快速检测试剂盒及其检测方法和应用

权利要求书

1.一种多残留金标快速检测试剂盒，所述试剂盒包括检测条和塑料卡壳，所述检测条由样品垫、金标抗体结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫组成；其特征在于所述金标抗体结合垫是由胶体金标记的庆大霉素单克隆抗体、胶体金标记的卡那霉素单克隆抗体和胶体金标记的氟喹诺酮类单克隆抗体组成；所述硝酸纤维素膜中部包被有检测线和控制线，检测线设置有能与金标抗体结合垫上三种单克隆抗体进行特异性结合的蛋白偶联物，蛋白偶联物分别为环丙沙星-BSA偶联物、庆大霉素-BSA偶联物、卡那霉素-BSA偶联物，控制线设置有羊抗鼠IgG单克隆抗体。

2.根据权利要求1所述的一种多残留金标快速检测试剂盒，所述金标抗体结合垫上的胶体金标记的庆大霉素单克隆抗体由庆大霉素单克隆抗体与25nm的胶体金颗粒结合组成。

3.根据权利要求1所述的一种多残留金标快速检测试剂盒，所述胶体金标记的卡那霉素单克隆抗体由卡那霉素单克隆抗体与25nm的胶体金颗粒结合组成。

4.根据权利要求1所述的一种多残留金标快速检测试剂盒，所述胶体金标记的氟喹诺酮类单克隆抗体由氟喹诺酮类单克隆抗体与60nm的胶体金颗粒结合组成。

5.根据权利要求1所述的一种多残留金标快速检测试剂盒，所述硝酸纤维素膜上检测线环丙沙星-BSA偶联物、庆大霉素-BSA偶联物、卡那霉素-BSA偶联物的包被浓度分别为0.08、0.13和0.15mg/mL，包被量均为1μL/cm。

6.根据权利要求1所述的一种多残留金标快速检测试剂盒，所述控制线上包被羊抗鼠IgG单克隆抗体，浓度为1mg/mL，包被量为1μL/cm。

7.根据权利要求1所述的一种多残留金标快速检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：

1）金标抗体结合垫的制备

a.空白胶体金的制备：

采用柠檬酸盐还原法制备胶体金颗粒，通过调节氯金酸和柠檬酸三钠加入量制备颗粒大小为25nm和60nm的胶体金溶液；

b.金标抗体重悬液的配制；

c.胶体金标记抗体的制备：

分别取金颗粒大小为25nm或60nm的胶体金溶液100mL，在搅拌状态下加入0.1M碳酸钾150～200μL，保持7～10分钟后，缓慢加入相应单克隆抗体进行抗体的金标记，继续搅拌30min后逐滴加入25%的BSA溶液使之终浓度达到0.4%，持续搅拌30min，最后离心，吸除上清，用金标抗体重悬液将沉淀金标抗体充分重悬；整个反应温度控制室温；

庆大霉素单克隆抗体使用25nm的胶体金颗粒进行标记，标记量为3μg/mL；卡那霉素单克隆抗体使用25nm的胶体金颗粒进行，标记量为3μg/mL；氟喹诺酮类单克隆抗体使用60nm的胶体金颗粒进行标记，标记量为5μg/mL；

d.金标抗体结合垫的制备：

将重悬好的金标抗体包被于预先切割好的尺寸为1cm*30cm的玻璃纤维素膜上，包被量为2mL/30cm，37℃干燥过夜，密封避光干燥处保存；

2)硝酸纤维素膜上T、C线的包被

a.庆大霉素-蛋白偶联物的制备

称取40mg庆大霉素硫酸盐和10mgBSA，分别溶解于1mL的蒸馏水中，将BSA溶液逐滴加入到庆大霉素溶液中，室温下于磁力搅拌器上搅拌2h以上；取120mg EDC·HCl溶于1mL蒸馏水中，再逐滴加入到上述溶液中，在室温下继续搅拌1h以上，然后于4℃放置过夜；用PBS透析3天后，分装，-20℃贮存；

b.卡那霉素-蛋白偶联物制备

称取卡那霉素硫酸盐28mg和BSA14mg分别溶于500ul蒸馏水中，混合后于磁力搅拌器上搅拌。取76mgEDC·HCl溶于1mL蒸馏水中，再逐滴加入到上述混合溶液中，在室温下搅拌过夜。用0.01MPBS透析3次以上，离心分装，-20℃贮存；

c.环丙沙星-蛋白偶联物的制备

称取20mg环丙沙星盐酸盐、10mgNHS和12．5mgEDC·HCl充分溶解于1mLDMF中，于室温下搅拌24h，得到CPLX反应液。再称取BSA 50mg，使之充分溶解在3mL PBS，pH值7.4，将CPLX反应液逐滴缓慢滴加到该BSA溶液中，并于室温下搅拌3h，然后用PBS透析3d，每天换2次透析液，以除去未反应的小分子物质。以3000r／min离心20min，收集上清，并分装-20℃贮存；

d.T、C线的包被

调试好二维喷点平台，将配制好的三种蛋白偶联物通过划线的方式按顺序包被在硝酸纤维素膜上作为检测线，同时进行羊抗鼠单克隆抗体的包被作为控制线，37℃干燥2h，密封避光干燥处保存；

硝酸纤维素膜上包被有三条检测线和一条控制线，三条检测线为环丙沙星-BSA偶联物、庆大霉素-BSA偶联物、卡那霉素-BSA偶联物，其包被浓度分别为0.08、0.13和0.15mg/mL，包被量均为1μL/cm；控制线上包被羊抗鼠单克隆抗体，浓度为1mg/mL，包被量为1μL/cm；

3)试纸条的组装

将样品垫、金标抗体结合垫、硝酸纤维素膜以及吸水垫按序搭接黏贴在PVC底板上，将贴好的底板在切条机上切割成宽为4mm的试纸条，试纸条固定在塑料卡壳内。

8.如权利要求1-6任一所述的多残留金标快速检测试剂盒在食品检测中的应用。