[发明专利]一种比伐卢定的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及多肽合成领域，特别涉及一种比伐卢定的制备方法。

背景技术

比伐卢定（Bivalirudin），氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，即D-Phe-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH，是一种应用于临床的凝血酶抑制剂，早期的临床研究表明比伐卢定抗凝治疗效果确切，且出血事件的发生率较低，和传统的肝素抗凝治疗相比使用更为安全。比伐卢定可通过结合于催化剂位点和循环及凝血酶血块的阴离子输出位点而直接抑制凝血酶的作用。

关于比伐卢定的制备方法，国内外已有大量报道。中国专利CN101475631B报道了采用全液相方法合成比伐卢定。首先合成三条分别含有6，6，8个氨基酸全保护片段，然后在液相中将三个片段依次偶联。同时，专利CN102164609A和专利CN102264757A中亦报道了类似的全液相合成方法，只是将片段分别分为了4条和5条。

US20070093423报道了一种比伐卢定的制备方法，其采用的是片段缩合方法得到粗品，经HPLC纯化得到比伐卢定精肽的纯度大于98.5%，总杂小于1.5%，单杂小于1.0%，[Asp9-比伐卢定]小于0.5%。

中国专利200910051311公开了一种比伐卢定的Fmoc固相顺序合成方法，采用王树脂为起始树脂，依次接入保护氨基酸，所得肽树脂采用三氟乙酸酸解得到比伐卢定粗品。

WO91/02750报道了一种采用Boc方法制备比伐卢定的方法，采用Merrifiled树脂为固相载体进行合成，最终采用HF酸解。

目前的合成方法有的采用液相合成，但由于比伐卢定的结构属于多肽类似物，肽序长，液相反应较为繁琐，不易纯化，合成起来花费时间较长，收率低；此外，所述部分专利虽采用固相合成比伐卢定，但比伐卢定结构中含有一个-Gly-Gly-Gly-Gly片段，在依次偶联-Gly过程中，由于Gly自身特性，极易在主峰前后产生Bivalirudin±1Gly和Bivalirudin±2Gly的杂质，这些杂质在后续分离时很难去除，且部分专利固相合成时，裂解用到HF，设备性能要求高，条件较为苛刻，不利于工业化生产。此外，比伐卢定肽序中含D-Phe，合成过程会产生其异构体L-Phe。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种比伐卢定的制备方法。该方法采用固相合成的多肽片段Fmoc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-OH为原料，避免了Bivalirudin±1Gly和Bivalirudin±2Gly的问题；此外，本发明采用特定偶联试剂使该异构体L-Phe的量大大降低；同时提高了产品的收率和纯度，操作简便，条件温和，有利于实现规模化的制备。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种比伐卢定的制备方法，包括如下步骤：

步骤1：取甘氨酸与氯树脂经第一偶联获得甘氨酸-氯树脂，取氨基酸依次经第二偶联获得第一肽树脂，经第一裂解获得序列如SEQ ID No.1所示的第一片段；

步骤2：取亮氨酸与固相载体经第三偶联获得亮氨酸-树脂，取氨基酸依次经第四偶联获得序列如SEQ ID No.2所示的第二肽树脂；

步骤3：取第一片段与序列如SEQ ID No.2所示的第二肽树脂固相偶联获得比伐卢定肽树脂，经第二裂解、纯化，即得；

第二偶联的偶联剂为HOBt与DIC的混合物，HOBt、PyBOP与DIPEA的混合物，HOAt、PyAOP与DIPEA的混合物，HBTU、HOBt与DIPEA的混合物，HATU、HOAt与DIPEA的混合物。

比伐卢定结构中含有一个-Gly-Gly-Gly-Gly片段，在依次偶联-Gly过程中，由于Gly自身特性，极易在主峰前后产生Bivalirudin±1Gly和Bivalirudin±2Gly的杂质，这些杂质在后续分离时很难去除。本发明采用固相合成的多肽片段Fmoc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-OH为原料，避免了Bivalirudin±1Gly和Bivalirudin±2Gly的问题。

比伐卢定肽序中含D-Phe，合成过程会产生其异构体L-Phe，采用特定偶联试剂能够使该异构体L-Phe的量大大降低。在本发明提供的比伐卢定的制备方法中，步骤1中第二偶联的偶联剂为HOBt、PyBOP与DIPEA的混合物。