[发明专利]一种基因重组纤维素分解酵母菌方法

权利要求书

1.一种基因重组纤维素分解酵母菌方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)纤维素酶基因cDNA模板制备

以里氏木霉或者枯草芽孢杆菌作为供体菌株，将供体菌株中的mRNA通过逆转录获得cDNA；以获得的cDNA为目标基因模板备用；

(2)基因克隆片段制备

在NCBI数据库中确定供体菌株的纤维素酶系中的Cx酶、C1酶和beta-葡萄糖苷酶3个目标基因的cDNA基因片段图谱，并针对基因片段图谱设计PCR反应的上下游引物；

以具有发酵产生酒精能力的酵母菌作为载体菌株，利用PCR反应，将载体菌株所需的3种特定基因表达片段的cDNA克隆，获得目标基因克隆片段；

(3)将目标基因克隆片段嵌入载体质粒，构建基因重组质粒

以pPICZα作为载体质粒，将步骤(2)中所述的3组PCR产物分别与pPICZα在缓冲液中进行三次酶切，酶切时温度控制在37℃，酶切时间2小时；

每次酶切完成后，均用T4-DNA连接酶将3个目标基因片段中的每一个都插入pPICZα中，获得基因重组质粒；

(4)基因重组质粒的筛选与鉴别

将步骤(3)获得的基因重组质粒导入大肠杆菌中，在含有25ug/ml博来霉素的低盐LB平板培养基上筛选抗性生长良好的菌落；

选取5-8个抗性生长良好的单菌落，纯化后提取基因重组质粒；

测序鉴定基因重组质粒，获得扩增好的基因重组质粒；

(5)基因重组质粒导入酵母表达系统

将步骤(4)中获得的基因重组质粒用SacI酶进行线性化后，用电击法将构建好的基因重组质粒导入载体菌株中，获得基因重组酵母菌；

(6)基因重组酵母菌的筛选与鉴别

电击结束后，立即加入温度为0℃、浓度为1mol/L的山梨醇1ml，非剧烈快速混匀后，吸取25-200ul，涂抹在含100ug/ml博来霉素的YPDS培养皿上，正方1小时后倒置于恒温培养箱中，在30℃的恒温条件下培养3-5天，直至形成生产良好的阳性单克隆；选取10-20个单菌落在含100ug/ml博来霉素的LB平板培养基上纯化，获得目标菌株；

(7)重组基因表达的诱导

挑选步骤(6)中得到的纯化的目标菌株，在YPD培养基中震荡培养过夜；从YPD培养基中取100ul培养液置于BMGY培养基中震荡培养过夜；在4℃的恒温条件下，3500g离心-10min；去细胞沉淀悬浮于盛有25ml培养液的BMMY培养基中，并加入甲醇，至甲醇的终浓度为0.5％，在30℃的恒温条件下，震荡培养3-4天，诱导目标重组基因表达。

2.根据权利要求1所述基因重组纤维素分解酵母菌方法，其特征在于：所述载体菌株为毕赤酵母菌GS115。

3.根据权利要求2所述基因重组纤维素分解酵母菌方法，其特征在于：所述PCR反应的上下游引物序列如下：

Cx酶：上游引物ATGGCGCCCTCAGTTACACT

      下游引物GATTTCCGTAACGCTCATCA

C1酶：上游引物ATGTATCGGAAGTTGGCCGT

      下游引物TTACAGGCACTGAGAGTAGT

beta-葡萄糖苷酶：上游引物ATGCGTTACCGAACAGCAGC

                 下游引物CTACGCTACCGACAGAGTGCT。

4.根据权利要求3所述基因重组纤维素分解酵母菌方法，其特征在于：步骤(3)中所述的三次酶切中，第一次酶切是Cx酶的上下游引物、C1酶的上下游引物和beta-葡萄糖苷酶的上下游引物分别与pPICZα用限制性内切酶Xho I进行酶切；第二次酶切是Cx酶的上下游引物、C1酶的上下游引物和beta-葡萄糖苷酶的上下游引物分别与pPICZα用限制性内切酶Xba I进行酶切；第三次酶切是Cx酶的上下游引物、C1酶的上下游引物和beta-葡萄糖苷酶的上下游引物分别与pPICZα用限制性内切酶Not I进行酶切。