[发明专利]一种基因重组纤维素分解酵母菌方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物方法，具体地说，涉及一种基因重组纤维素分解酵母菌方法。

背景技术

纤维素、木质素一直是世界上总量最为巨大的可再生资源，所有植物中均含有，其最终分解物为各种小分子糖类：如葡萄糖、果糖等。都是许多其他生产活动所必须的优质的原材料，特别是在可再生生物能源领域。然而，由于纤维素结构十分稳定，其分解的生物学变化比较复杂，在自然界中极难被充分降解，并且即便能够适当降解，其耗时也过长，很难从经济角度产生价值。

目前，社会上现有的对于纤维素、木质素这类储量庞大的可再生资源的利用还基本停留在细胞层面，特别是在国内。由于纤维素等的分解需要多种酶和生化反应的参与，现有的技术主要通过将具有不同能力的多种微生物混合，通过各种微生物在整个分解过程中的不同环节发挥各自的作用，以最终分解纤维素。然而，从微生物学角度来说，在同一生态体系中的各微生物之间多存在拮抗作用。也就是说，由于营养物质的总量或空间大小固定，各菌种生长过程中为争夺营养物质或生存空间，确保自己是优势菌株，都会尽量抑制其他菌种的生长。同时，各不同菌种对于最佳生长环境的温度、湿度等要求不同。因此，多种菌种混合，很难使得各菌种都能同时获得最好生长条件。也就是说每一种菌株在实际过程中，很难有效的发挥其预计的在纤维素分解中特定环节的作用，从而使得纤维素分解的整个生化流程出现一个或多个瓶颈点，最终严重影响纤维素分解的效率，增加分解所需的时间。

PCR方法，即聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction)，是利用单链寡核苷酸引物对特定DNA片段进行体外快速扩增的一种方法。

电击法，利用高压电脉冲的电击穿孔作用将质粒DNA导入植物原生质体的方法。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中的缺陷，提供一种基因重组纤维素分解酵母菌的方法。

为解决上述问题，本发明所采用的技术方案是：

一种基因重组纤维素分解酵母菌方法，其特征在于：包括如下步骤：

1、纤维素酶基因cDNA模板制备

以里氏木霉或者枯草芽孢杆菌作为供体菌株，将供体菌株中的mRNA通过逆转录获得cDNA；以获得的cDNA为目标基因模板备用；

2、基因克隆片段制备

在NCBI数据库中确定供体菌株的纤维素酶系中的Cx酶、C1酶和beta-葡萄糖苷酶3个目标基因的cDNA基因片段图谱，并针对基因片段图谱设计PCR反应的上下游引物；

以具有发酵产生酒精能力的酵母菌作为载体菌株，利用PCR反应，将载体菌株所需的3种特定基因表达片段的cDNA克隆，获得目标基因克隆片段；

3、将目标基因克隆片段嵌入载体质粒，构建基因重组质粒

以pPICZα作为载体质粒，将步骤2中所述的3组PCR产物分别与pPICZα在缓冲液中进行三次酶切，酶切时温度控制在37℃，酶切时间2小时；

每次酶切完成后，均用T4-DNA连接酶将3个目标基因片段中的每一个都插入pPICZα中，获得基因重组质粒；

4、基因重组质粒的筛选与鉴别

将步骤3获得的基因重组质粒导入大肠杆菌中，在含有25ug/ml博来霉素的低盐LB平板培养基上筛选抗性生长良好的菌落；

选取5-8个抗性生长良好的单菌落，纯化后提取基因重组质粒；

测序鉴定基因重组质粒，获得扩增好的基因重组质粒；

5、基因重组质粒导入酵母表达系统

将步骤4中获得的基因重组质粒用SacI酶进行线性化后，用电击法将构建好的基因重组质粒导入载体菌株中，获得基因重组酵母菌；

6、基因重组酵母菌的筛选与鉴别

电击结束后，立即加入温度为0℃、浓度为1mol/L的山梨醇1ml，非剧烈快速混匀后，吸取25-200ul，涂抹在含100ug/ml博来霉素的YPDS培养皿上，正方1小时后倒置于恒温培养箱中，在30℃的恒温条件下培养3-5天，直至形成生产良好的阳性单克隆；选取10-20个单菌落在含100ug/ml博来霉素的LB平板培养基上纯化，获得目标菌株；

7、重组基因表达的诱导

挑选步骤6中得到的纯化的目标菌株，在YPD培养基中震荡培养过夜；从YPD培养基中取100ul培养液置于BMGY培养基中震荡培养过夜；在4℃的恒温条件下，3500g离心10min；去细胞沉淀悬浮于盛有25ml培养液的BMMY培养基中，并加入甲醇，至甲醇的终浓度为0.5％，在30℃的恒温条件下，震荡培养3-4天，诱导目标重组基因表达。

进一步地说：