[发明专利]烯啶虫胺半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法与应用

权利要求书

1.一种烯啶虫胺半抗原，其特征在于分子结构式为：

2.一种烯啶虫胺免疫原，是由权利要求1所述的烯啶虫胺半抗原与牛血清蛋白相连接合成，其特征在于，所述烯啶虫胺人工抗原分子结构式为：

3.一种烯啶虫胺包被原，是由权利要求1所述的烯啶虫胺半抗原与卵清蛋白相连接合成，其特征在于，所述烯啶虫胺包被原分子结构式为：

4.一种烯啶虫胺抗体，是能与权利要求2免疫原或权利要求3包被原发生特异性免疫反应的IgG抗体。

5.权利要求1所述的烯啶虫胺半抗原的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）将烯啶虫胺5.400-5.500g溶于40ml甲醇，投入三口烧瓶中；

（2）加入KOH 2.200-2.300g，磁力搅拌使其溶解；

（3）称取3-巯基丙酸2.100-2.200g溶于10ml甲醇并转移至50ml恒压滴液漏斗中缓慢滴加到三口烧瓶中，并使油浴缓慢升温至100-105℃，反应完全后撤去油浴，反应液自然冷却至室温后，用旋转蒸发仪蒸干溶剂即得到目标产物。

6.权利要求2所述的烯啶虫胺免疫原的制备方法为活性酯法，其特征在于，所述活性酯法包括以下步骤：

（1）首先移取1mL的无水二甲基甲酰胺于4mL的小棕瓶中；

（2）称取5.100-5.200mg烯啶虫胺半抗原溶于上述二甲基甲酰胺溶液中并超声5min使其溶解充分，在搅拌的状态下，依次向其中加入15.600-15.700mgN,N＇二环己基碳二亚胺和8.700-8.800mgN-N-羟基琥珀酰亚胺，溶解充分以后，室温避光搅拌反应22-24小时；

（3）反应后溶液中有沉淀产生，4℃，10000r/min离心5min除去沉淀，将上清液逐滴加入冰浴条件下的4mL含20mg牛血清白蛋白的pH7.4的0.01mol L^-1的磷酸盐缓冲液中，室温搅拌1-1.5小时后，将该溶液置于4℃冰箱搅拌过夜；

（4）将步骤（3）反应液吸出装入透析袋，在4℃条件下用pH7.4的0.01mol L^-1磷酸缓冲液透析三天，每天换四次透析液，最后将透析液取出，得到烯啶虫胺免疫原；

（5）精确量取步骤（4）得到烯啶虫胺免疫原溶液的体积，测定浓度和结合比，分装，-20℃保存。

7.权利要求3所述烯啶虫胺包被原的制备方法为混合酸酐法，其特征在于，所述的混合酸酐法包括以下步骤：

（1）首先移取1mL的无水二甲基甲酰胺于4mL的小棕瓶中；

（2）称取5.100-5.200mg烯啶虫胺半抗原溶于二甲基甲酰胺中并超声5min使其充分溶解，在搅拌的状态下，依次向其中加入2uL氯甲酸异丁酯和4uL正三丁胺，室温避光搅拌反应1-1.5h；

（3）反应后将反应液在冰浴条件下逐滴加入含有20mg卵清蛋白的4mL磷酸盐缓冲液，室温搅拌2h后，将该溶液置于4℃冰箱搅拌过夜；

（4）将步骤（3）的反应液吸出装入透析袋，在4℃条件下用pH7.4的0.01mol L^-1磷酸盐缓冲液透析三天，每天换四次透析液，最后将透析液取出分装，加入0.1%的叠氮钠4℃保存。

8.权利要求4所述烯啶虫胺抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）免疫：免疫动物选用雌性大白兔，免疫方法采用皮下和肌肉注射法，初免后进行四次加强免疫，具体做法是：

初次免疫：取1mg上述免疫原溶于0.9％的NaCl溶液和弗氏完全佐剂等体积所配制的溶液中，进行动物免疫；

加强免疫：用0.5mg上述免疫原溶于0.9％的NaCl溶液和弗氏不完全佐剂等体积所配制的溶液，进行动物免疫；加强免疫分别于初次免疫后2周、4周和6周后免疫三次，此后间隔一个月。第五次免疫后9天时由兔子的耳缘静脉取血，进行效价检测；

（2）抗体纯化：定时监测动物抗体效价，当抗体对权利要求3所述的烯啶虫胺包被原效价达到1:80000-1:90000时，采集血液，并离心获得抗血清，使用ProteinA-Sepharose 4B蛋白亲和层析柱对抗血清进行纯化，制备得到权利要求4所述的IgG抗体。

9.权利要求4所述烯啶虫胺抗体的应用，其特征在于，所述的烯啶虫胺抗体应用于农药烯啶虫胺含量的免疫检测。

10.根据权利要求9所述的烯啶虫胺抗体的应用，其特征在于包括如下步骤：

（1）包被：将制备好的包被原溶于50mmol、pH9-10的碳酸缓冲液中，配制成10mg/mL的包被液，酶标条的每个孔加100μl包被液包被12-16小时，将包被好酶标板的每个孔，用PBST洗涤三次；

（2）封闭：每孔加入200μl含有0.5%(m/v)脱脂乳粉的pH7.4的磷酸缓冲液封闭30分钟；

（3）加样：将待测样品溶于pH7.4的磷酸缓冲液中，加样时每孔加入50μl标样；

（4）竞争反应：将抗体溶于pH7.4的磷酸缓冲液中，加入待测样品或标样后，每孔加入50μl抗体溶液，孵育30分钟后用洗板液洗涤三次；

（5）加酶标二抗：将羊抗兔酶标二抗用pH7.4的磷酸缓冲液20000倍稀释，每孔加入100μl，室温孵育30分钟后用洗板液洗涤三次；

（6）显色：显色底物使用四甲基联苯胺，将5mg四甲基联苯胺溶于1ml pH7.4的磷酸缓冲液中,配制成浓度为0.1%的底物溶液，显色时每孔加入150μl的底物溶液和5μl双氧水，显色15分钟后每孔加入50μl 5mol/L的硫酸终止；反应液在自动酶标仪上读数。