[发明专利]大豆细菌性斑点病菌harpinZPsgA1蛋白的表达和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物基因工程领域，更具体地说，涉及一种编码植物多功能活性和广谱抗性细菌信号因子hrpZ_PsgA1基因的克隆及其高效表达产物的纯化，以及该纯化蛋白harpinZ_PsgA1促进植物生长及抗病方面的应用。 

背景技术

大豆是一种其种子含有丰富的蛋白质的豆科植物，其种子呈椭圆形、球形，颜色有黄色、淡绿色、黑色等，故又有黄豆、青豆、黑豆之称，是豆科植物中最富有营养而又易于消化的食物，是蛋白质最丰富最廉价的来源，在今天世界上许多地方是人和动物的主要食物。大豆具有多种用途，最常用来做各种豆制品、榨取豆油、酿造酱油和提取蛋白质，而豆渣或磨成粗粉的大豆也常用于禽畜饲料，是最重要的经济作物之一。 

高等植物过敏性反应（hypersensitive response；HR）是植物受到病原细菌侵染，发生非亲和性反应时，在病原菌入侵点周围植物组织局部快速死亡形成枯斑，是植物对病原菌抗性的一种普遍表现形式。hrp基因（hypersensitive reaction and pathogencity gene）是一类决定病原菌对寄主植物致病性和诱导非寄主植物产生过敏性反应的基因。hrp基因是由多个hrp位点组成的基因簇，具有复杂的结构，并具有至少四方面的功能：基因调控、蛋白质泌出和编码HR反应激发子，以及参与细菌纤毛（pilus）的合成。在hrp基因所编码的HR反应激发子中，harpin是一类非特异性蛋白质激发子，该蛋白质富含甘氨酸，不含半胱氨酸，对热稳定，对蛋白酶K敏感，可以在非寄主植物烟草上激发过敏反 应，并且过敏反应可以被真核生物代谢抑制剂抑制，是目前研究得较为深入的一类细菌分泌蛋白。Wei（1992）首次从梨火疫（E.amylovora）中分离得到一种能引起过敏反应的蛋白激发子HrpN，随后在丁香假单胞菌和青枯假单胞菌中也分离到了相应的harpin类蛋白。 

以往研究表明，harpin可以通过启动多种信号途径来诱导植物获得抗性，harpin蛋白可以通过启动至少三条信号通路即：水杨酸（SA）信号通路、茉莉酸（JA）/乙烯（ET）信号通路和脱落酸（ABA）信号通路来诱导植物获得多种有益表型，如促进生物生长，使植物增强对病原菌和害虫的抗性，作为新型微生物蛋白农药的代表具有广泛的应用前景。 

大豆细菌性斑点病是我国，尤其是北方，大豆产区的一种主要病害，给我国的大豆生产带来巨大损失。大豆细菌性斑点病主要危害大豆的幼苗、叶片、叶柄、茎及豆荚。幼苗染病子叶生半圆形或近圆形褐色斑。叶片染病初生褪绿不规则形小斑点，水渍状，扩大后呈多角形或不规则形，大小约3～4mm，病斑中间深褐色至黑褐色，外围具一圈窄的褪绿晕环，病斑融合后成枯死斑块。茎部染病初呈暗褐色水渍状长条形，扩展后为不规则状，稍凹陷。荚和豆粒染病生暗褐色条斑。大豆细菌性斑点病的致病菌为丁香假单胞菌大豆致病变种（Pseudomonas syringae pv.glycinea），其也是世界范围内重要的植物病原细菌。 

因此，有获取可有效提高植株对丁香假单胞菌大豆致病变种的抗性，促进植株生长的harpin类蛋白及其相关的生物制品的需要。 

发明内容

本发明的目的为提供大豆细菌性斑点病菌的harpin类蛋白，表达所述蛋白的重组载体及其构建的工程菌。 

本发明是通过如下技术手段实现的： 

在本发明的第一方面，提供了一种编码具有harpin蛋白功能的氨基酸序列的核苷酸序列hrpZ_PsgA1，所述核苷酸序列含有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列或与其互补的核苷酸序列。 

在本发明的第二方面，提供了一种载体，其特征在于，所述载体含有第一方面所述的核苷酸序列，优选地，所述载体为pET41a(+)-hrpZ_PsgA1重组载体。 

在本发明的第三方面，提供了第二方面所述的pET41a(+)-hrpZ_PsgA1重组载体的构建方法，其由以下方法构建： 

（1）将大豆细菌性斑点病菌A1菌株在28℃条件下于KB固体培养基上培养，之后提取A1菌株基因组DNA，用5'端分别引入BamH1和EcoR1酶切位点的引物对hrpZ_PsgA1-P1和hrpZ_PsgA1-P2以A1菌株的基因组DNA为模板进行PCR扩增：