[发明专利]一种月月红体细胞胚胎发生及植株再生方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种月月红体细胞胚胎发生及植株再生方法，尤指一种以2,4-D和TDZ共同诱导中国月季月月红体细胞胚胎发生的方法及该方法在月月红快速繁殖、基因转化、人工体胚中的应用。

背景技术

体细胞胚胎发生(Somatic Embryogenesis)是指在离体培养条件下植物的体细胞通过与合子胚类似的途径发育成新个体的过程。由于其速度快、数量大、结构完整等特点，利用体细胞胚胎发生进行乔木树种的人工种子育苗，可能成为未来人工林苗木来源的一种重要手段；由于体细胞胚胎往往产生于单个细胞，通过体细胞胚胎发生途径进行基因转化，有利于获得纯合的转基因植株；此外,胚性培养物是全能性原生质体的重要来源，可用于树种的遗传转化及体细胞杂交等研究，达到改良森林树种的目的。

体细胞胚胎发生是植物界的普遍现象,自1948年Curits等从兰属杂种胚愈伤组织中首次发现和正常胚相似的胚状体结构以来，已在43科97属114种植物中有了体细胞胚胎发生的报道。木本植物的体细胞胚胎发生研究起步较晚，但这个领域的研究却取得了令人瞩目的进展。据初步统计已从挪威云杉、油棕、石刁柏、欧洲七叶树、胡桃楸、花旗松等树种中有体细胞胚胎发生报道。月季是世界四大切花之一，也是中国十大名花之一，其中中国古老月季月月红是现代月季的鼻祖，在月季/玫瑰育种中占有非常重要的位置。月季的体细胞胚胎发生虽已有报道，但未见月月红体胚胎成功的报道。

本发明人一直从事月月红体细胞胚胎发生和再生研究，发现通过激素调控可以诱导月月红的器官发生（Organogenesis），直接产生芽，但是诱导率和再生率非常低，未见合子胚类似的体胚发生。不能形成快速、完整、幼化再生株系，难以通过基因转化途径改良月季（月月红）。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：针对上述现有技术的不足，提供一种月月红体细胞胚胎发生及植株再生方法，是含2,4-D、TDZ、ABA、GA₃和L-脯氨酸的多种培养基在不同光质和光强条件下的应用，具体地说，就是用上述激素和有机物组成搭配成不同培养基，在不同光质和光强条件下对月月红叶柄体细胞进行分阶段诱导，最后诱导出体细胞胚胎和再生植株。

为了解决上述技术问题，本发明所采用技术方案是：一种用于月月红体细胞胚胎发生的胚性愈伤诱导方法，该方法是将带有0.8-1.2mm叶柄的月月红无菌芽嫩叶置于EP培养基中，在23℃～27℃黑暗培养2-6个月（一般2个月就可以获得愈伤组织，如需获得更多愈伤组织，可以延长时间），得到透明水渍状或浅棕色的胚性愈伤组织；EP培养基组成：SH培养基+2,4-D3.0mg/L+TDZ1.0mg/L+ L-脯氨酸300.0 mg/L，并加入4.0g/L 琼脂糖固化培养基，pH值为5.4。在该培养条件下，月月红的愈伤组织可以长期培养，并保护体细胞胚胎发生能力。 

上述无菌芽是取一年生半木质化枝条表面消毒后，置于SP培养基上培养1-3个月得到；SP培养基组成：MS固体培养基+6-BA2.0mg/L+NAA 0.1mg/L+GA₃3.0mg/L，pH值为6.0，121℃、125 kPa灭菌15min，培养条件：温度为23℃～27℃，每天16h光照，8h黑暗，光照强度为白光1600Lux，。上述表面消毒是指先用70%体积浓度的酒精消毒30秒，再置于0.3%体积浓度的次氯酸钠溶液中15分钟，最后用无菌水清洗3次。

本发明还提供一种月月红体细胞胚胎发生方法，该方法是将上述月月红胚性愈伤组织置于EM培养基上培养1-3个月，得到两片子叶为主的体细胞胚；EM培养基组成：SH培养基+2,4-D1.0mg/L+TDZ0.2mg/L+L-脯氨酸300mg/L+ABA2.5mg/L+ GA₃3.0mg/L，培养条件：温度为23℃～27℃，每天16h光照，8h黑暗，光照强度为红光400Lux。

本发明另提供一种月月红体细胞胚胎再生植株方法，该方法是将上述月月红体细胞胚置于SP2培养基上培养1-3个月以产生芽，再按常规技术培育出植株；SP2培养基组成：MS固体培养基+6-BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L+L-脯氨酸300mg/L+ GA₃3.0mg/L，培养条件：温度为23℃～27℃，每天16h光照，8h黑暗，光照强度为普通白光1600Lux。

本发明还提供在月月红转基因和种质改良、创新中的应用，以及在月月红人工种子制作、良种推广中的应用。