[发明专利]一种基于微流控芯片的糖尿病血管病变模型的建立方法

权利要求书

1.一种微流控芯片，其特征在于：该微流控芯片主要由细胞入口池(1)、细胞培养室(2)和出口池(3)组成；细胞培养室(2)上连细胞入口池(1)，细胞培养室(2)下连出口池(3)。

2.按照权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于：所述微流控芯片由上下两层不可逆封接而成，上层材料为可透光透气的PDMS聚合物，下层材料为浓硫酸煮过的洁净玻璃。

3.按照权利要求2所述的微流控芯片，其特征在于：所述微流控芯片的上下两层分别进行紫外过夜照射的灭菌处理，然后等离子体处理30-45s进行封接。

4.一种基于权利要求1所述微流控芯片的糖尿病血管病变模型的建立方法，其特征在于：方法过程如下：

(1)芯片修饰

用移液器将配制好的胶原工作液经由细胞入口池加入芯片，将固定芯片的培养皿常温静置过夜，12-36小时之内移除胶原工作液，细胞培养液冲洗通道2-4次，对通道底面进行修饰，促进人脐静脉内皮细胞(HUVEC)更好地贴壁；

(2)芯片内细胞的接种与培养

HUVEC细胞消化后，调整至合适的细胞密度，经由细胞入口池加入到芯片中，在胶原的修饰作用下，细胞迅速贴壁并均匀铺展于细胞培养室底面，当在光学显微镜下观察到细胞在细胞培养室中均匀分布时，立即将芯片移入二氧化碳培养箱中继续培养；

(3)糖尿病血管病变模型的建立

待HUVEC细胞经过增殖完全铺满细胞培养室底面后，经由细胞入口池分别向4个通道中通入不含血清的细胞培养液并继续培养24-36小时，使HUVEC细胞处于相同的生长期，随后分别依次向4个通道中通入含有不同葡萄糖浓度的细胞培养液继续48小时，模拟糖尿病患者血管壁所处的高糖环境。

5.按照权利要求4所述的基于微流控芯片的糖尿病血管病变模型的建立方法，其特征在于：所述芯片内细胞的接种与培养时，细胞密度为5×10⁶cells/mL。

6.权利要求4建立的糖尿病血管病变模型的芯片内细胞活性考察及血管病变部位细胞表面结构与功能变化的表征，其特征在于：方法过程如下：

(1)用碘化丙啶表征培养两天后细胞的生长状态及活性；

(2)常规免疫荧光染色法表征高糖作用后的HUVEC细胞内及细胞表面eNOS、vWF、ICAM-1、VCAM-1、integrin-β4以及粘着斑蛋白的表达，用于表征糖尿病血管病变部位相应结构和功能的变化，主要表征细胞表面粘附性的变化。

7.按照权利要求6所述的芯片内细胞活性考察及血管病变部位细胞表面结构与功能变化的表征，其特征在于，所述的蛋白表达检测的方法为细胞免疫荧光染色。

8.一种权利要求4建立的糖尿病血管病变模型应用于研究单核细胞在病变部位内皮细胞表面的黏附与滚动现象的方法，其特征在于：该方法过程如下：

将培养48-72小时的白血病单核细胞稀释成1×10⁶-5×10⁶cells/mL的细胞悬液，置入二氧化碳培养箱中备用；将不同葡萄糖浓度培养液刺激后的糖尿病血管病变模型芯片取出，经由细胞入口池以设定的流速通入单核细胞的细胞悬液，显微镜持续拍摄单核细胞在HUVEC细胞表面的黏附与滚动现象，统计发生粘附与滚动的单核细胞数目，通过Image ProPlus软件分析单核细胞运动的速度与轨迹。

9.按照权利要求8所述建立的糖尿病血管病变模型应用于研究单核细胞在病变部位内皮细胞表面的黏附与滚动现象的方法，其特征在于：所述显微镜持续拍摄单核细胞在HUVEC细胞表面的黏附与滚动现象时，每隔50ms拍照一张，共拍摄80张，具体实时监测时间为4s。