[发明专利]一种基于微流控芯片的糖尿病血管病变模型的建立方法

说明书

技术领域

本发明涉及将微流控芯片技术应用到组织仿生以及实时监测的细胞生物学研究的技术领域，具体涉及一种基于微流控芯片的糖尿病血管病变模型的建立方法，并应用于单核细胞在病变部位表面的运动特征的研究方法。

背景技术

医学研究显示，有50%的心脑血管疾病是由糖尿病引起的。糖尿病人群中血管疾病患病率的增加主要原因是动脉粥样硬化的速度加快。与非糖尿病个体相比，糖尿病或糖耐量异常的个体常伴有其他代谢的异常，促进了动脉粥样硬化；同时，糖尿病增加了促凝血状态，加速了动脉粥样硬化的形成。因此，糖尿病患者发生动脉粥样硬化的年龄更早，进展成临床脑血管事件更快。

糖尿病与血管病变已逐渐成为当今医学和生物学界研究的热点，目前还主要集中于细胞水平的研究。细胞并不是一个孤立的生命体，细胞与细胞之间的相互作用也不是简单的机械连接，而是存在各种形式的相互交流的。探索细胞间相互作用及相应的信号通路，对疾病治疗等有着重要作用。

糖尿病与血管病变的研究发展至今，主要的研究手段仍旧依赖于孔板，集中观察单一或者多种因素刺激下细胞的形态变化、生长过程、迁移和增殖行为等。而在众多的细胞行为研究中，细胞运动作为生物体发育和形态建成等重要生命过程的基础，备受关注。细胞运动一般起始于细胞对其微环境刺激的反应，微环境刺激细胞表面受体并激活一系列的细胞内的信号转导通路，进而影响细胞间的相互作用，最终产生组织程度上的生理和病理学的变化。对于糖尿病而言，其所导致的血管病变主要为炎性黏附性增大引发的血栓和动脉粥样硬化，其过程与单核细胞在病变部位内皮细胞上的黏附与运动过程密切相关，并且在体内条件下，这一过程还要涉及到血液流动所产生的生物物理学因素。孔板实验很难在体外构建集成有流体剪切力这一生物物理学因素的糖尿病血管病变模型，所以想模拟和重现上述糖尿病所致血管病变的过程是比较困难的。

微流控芯片实验室又称芯片实验室或微流控芯片，指的是把生物和化学等领域中所涉及的样品制备、反应、分离、检测、细胞培养、分选、裂解等基本操作单元集成或基本集成到一块几平方厘米(甚至更小)的芯片上，由微通道形成网络，以可控流体贯穿整个系统，用以取代常规化学或生物实验室的各种功能的一种技术。微流控芯片技术作为一门迅速发展起来的科学技术，已经在生物医学领域展现了其独特的优势，更因其同细胞尺寸匹配、环境同生理环境相近、在时间和空间维度上能够提供更为精确的操控，易于通过灵活设计实现多种细胞功能研究等特点而成为新一代生物仿生和细胞研究的重要平台。目前，利用微流控芯片进行组织工程的模拟，尤其是糖尿病血管病变的模拟以及单核细胞在病变部位表面的运动特征研究分析还处于空白阶段。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于微流控芯片的糖尿病血管病变模型的建立方法，并应用于单核细胞在病变部位表面运动特征的研究，特别针对单核细胞在病变部位表面的黏附与滚动的特点，该方法具有对细胞运动实时监测的特点，同时能够实现对细胞运动速度和轨迹的准确表征。

本发明提供了一种微流控芯片，该微流控芯片主要由细胞入口池(1)、细胞培养室(2)和出口池(3)组成，细胞培养室(2)上连细胞入口池(1)，细胞培养室(2)下连出口池(3)。

本发明提供的微流控芯片，该微流控芯片由上下两层不可逆封接而成，上层材料为可透光透气的PDMS聚合物，下层材料为浓硫酸煮过的洁净玻璃。所述微流控芯片的上下两层分别进行紫外过夜照射的灭菌处理，然后等离子体处理30-45s进行封接。

本发明还提供了一种基于微流控芯片的糖尿病血管病变模型的建立方法，基本过程如下：

(1)芯片修饰

用移液器将配制好的胶原工作液经由细胞入口池加入芯片，将固定芯片的培养皿常温静置过夜，12-36小时（优选24小时）之内移除胶原工作液，细胞培养液冲洗通道2-4次（优选3次），对通道底面进行修饰，促进人脐静脉内皮细胞(HUVEC)更好地贴壁；

(2)芯片内细胞的接种与培养

HUVEC细胞消化后，调整至合适的细胞密度（细胞密度为5×10⁶cells/mL），经由细胞入口池加入到芯片中，在胶原的修饰作用下，细胞迅速贴壁并均匀铺展于细胞培养室底面，当在光学显微镜下观察到细胞在细胞培养室中均匀分布时，立即将芯片移入二氧化碳培养箱中继续培养；

(3)糖尿病血管病变模型的建立