[发明专利]一种荧光素标记核苷酸的制备方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种荧光素标记核苷酸的制备方法，具体涉及一种荧光素罗丹明B标记脱氧尿嘧啶核苷三磷酸的制备方法，而这种荧光素标记的DNA探针可广泛用于DNA荧光原位杂交临床检验，也可用于细胞凋亡荧光检测试剂盒。

背景技术：

人类基因组计划的完成促进了以核酸为基础的临床诊断、法医DNA鉴定、检验检疫技术的发展。因此核酸的定性与定量分析变得越来越重要。荧光素标记检测技术的诞生，极大促进了核酸测量技术的发展，该技术正逐渐取代传统同位素标记技术，在核酸测量中广泛应用。荧光素标记核苷酸作为荧光技术中的重要工具，已应用于医学、农业、环境和生物学等领域。随着应用领域的拓展，对荧光素标记核苷酸的质量控制、纯度和量值准确提出了更高的要求。

荧光素标记核苷酸Rhodamine-dUTP作为一种灵敏度高、量值准确的核酸探针标记原料，是生产荧光原位杂交临床检验试剂盒、细胞凋亡荧光检测试剂盒过程中的一种关键性中间产品。

发明内容：

本发明的目的是针对上述情况，提供一种荧光素标记核苷酸Rhodamine-dUTP的制备方法，其制备的Rhodamine-dUTP能够提高检测的特异性、可靠性、均一性和灵敏度。

为了实现上述目的，本发明提供的荧光素标记核苷酸Rhodamine-dUTP制备方法，主要包括以下的步骤：

(1)将丙烯胺-dUTP(脱氧尿嘧啶核苷三磷酸)原溶液加入到NaHCO₃缓冲溶液中制得溶液A。

(2)将Rhodamine(罗丹明B)溶解于DMSO(二甲基二砜)制得溶液B。

(3)使溶液A与与溶液B在室温下经过2.5-4.5小时的偶合反应作用之后，按以下顺序进行每一个反应：a加入甘氨酸使反应停止；b加入缓冲液用于稳定核苷酸；c加入水，使得dUTP溶液的终浓度为0.5-1.5mmol/L。

(4)将反应混合物加入层析柱，去除未标记的罗丹明B和dUTP，收集纯化的罗丹明-dUTP。

从而制的所需的荧光素标记核苷酸Rhodamine-dUTP。

本发明提供的技术方案的有益效果是：通过本方法可以获得标记率(纯度)较高的dUTP 99.9％，在-20℃下稳定一年以上，在-80℃下稳定三年以上。同时，由于荧光素罗丹明B较为廉价，使得该反应具有较高的经济效益。

附图说明：

图1是荧光素罗丹明B标记脱氧尿嘧啶核苷三磷酸的制备方法发明示意图，其中，1、溶液A配制罐2、溶液B配制罐3、偶合反应开始阶段4、偶合反应终止阶段5、偶合缓冲稳定阶段6、偶合液浓度调节阶段7、层析柱

具体实施方式

如图1所示，本发明的过程包括溶液A配制、溶液B配制、偶合、层析；偶合包含反应开始、反应终止、缓冲稳定和浓度调节。

将10-30mmol/L(毫摩尔)的丙烯胺-dUTP原溶液、0.1-0.3mmol/L的NaHCO₃缓冲溶液加入溶液A配制罐(1)中，制得溶液A；将与丙烯胺-dUTP相同摩尔量的罗丹明B(Rhodamine)在溶液B配制罐(2)中，溶解于DMSO(二甲基二砜)中制得溶液B。

使溶液A与溶液B在室温下进入偶合反应开始阶段(3)，进行偶合反应2.5-4.5小时；之后加入0.1-0.3n 2mol/L的甘氨酸(pH pH 7.0-9.0，溶液终浓度为10-30mmol/L)使偶合反应终止阶段(4)；反应终止后，加入0.3-0.5n 1mol/L Tris-HCl缓冲液(三羟甲基氨基甲烷与盐酸混合而得)，pH7.0-9.0(溶液终浓度为10-30mmol/L)，是偶合反应液进入缓冲稳定阶段(5)；再加入10-30n的水，进行偶合混合液的调节浓度阶段(6)，使得dUTP溶液的终浓度为0.5-1.5mmol/L。

最后将偶合反应混合物加入层析柱(7)，去除未标记的罗丹明和dUTP，收集纯化的Rhodamine-dUTP，最终获得的产物。