[发明专利]提高上面发酵小麦啤酒中4-乙烯基愈创木酚含量的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用基因工程技术提高啤酒中4-乙烯基愈创木酚含量的方法，属于基因工程技术领域。 

背景技术

4-乙烯基愈创木酚感官阈值很低，仅为0.3mg/L，即使痕量，也能使啤酒呈现药房味、酚味、丁香味或烟熏味，因而在大多数下面发酵啤酒中，其风味并不受欢迎，并且被称作是“酚异味（phenolic off-flavour）”。尽管对下面发酵啤酒而言是异味物质，但是众所周知，4-乙烯基愈创木酚却是形成比利时白啤酒（用未发芽的小麦酿造）、德国小麦啤酒（用小麦芽酿制）以及烟熏啤酒等上面发酵啤酒的必不可少的香味物质，也是该类啤酒全面风味评价不可或缺的特色成分。 

在啤酒酿造过程中，通过水解和酶解作用，许多酚酸会游离出来，在上面发酵啤酒酵母中酚酸脱羧酶的作用下，可以将其中的酚酸脱羧，形成4-乙烯基愈创木酚（呈丁香花味）等特色风味物质，可以显著地提高上面发酵小麦啤酒的香味。 

目前4-乙烯基愈创木酚主要是通过化学或生物法进行合成。如：中国专利文献CN101885669A（申请号201010229531.X）公开了一种4-乙烯基愈创木酚的制备方法，步骤为：（1）向反应器中依次投入喹啉、阿魏酸和作为阻聚剂的对苯二酚，打开加热装置，接通氮气保护装置，到体系无气体溢出停止加热，继续搅拌40-60分钟；（2）将上述反应中加入溶剂苯中搅拌均匀，并向该溶液中加入盐酸，搅拌均匀，然后静置分层，检测水相pH值为中性为止；最后向去离子水洗后的溶液中加入干燥剂无水氯化钙；（3）将干燥后的溶液放入蒸馏器中，在常压下将作为溶剂的苯蒸出，然后连接上真空泵在100℃以下的气相温度下将产品蒸出即可。由于该方法产生部分副产物及原料残留，无法直接添加到啤酒酿造过程中。 

中国专利文献CN101397568A（申请号200810233517.X）公开了一种通过基因克隆的方法获得ENTEROBACTER SP.PX6-4中分解阿魏酸生成4-乙烯基愈创木酚的关键酶阿魏酸脱羧酶的编码区序列、并通过异源表达技术在大肠杆菌(E.COLI BL21)中大量表达了该酶；通过纯化的方法获得了阿魏酸脱羧酶的纯品；运用悬滴结晶法得到阿魏酸脱羧酶的蛋白质结晶，并且掌握了该酶的结构及活性中心。由于阿魏酸是4-乙烯基愈创木酚的前体物质，在啤酒酿造过程中添加阿魏酸脱羧酶，虽然能够提高啤酒中的4-乙烯基愈创木酚含量，但效果无法满足实际需求。 

事实上，部分细菌和真菌含有PADC基因，编码酚酸脱羧酶（phenolic acid decarboxylase），在生物的降解代谢过程中起着非常重要的作用，例如不动杆菌Acinetobacter、荧光假单胞菌Pseudomonasfluorescens和枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis等，但PADC基因应用于啤酒酿造工艺中尚未见报道。 

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供了一种利用基因工程技术提高上面发酵小麦啤酒中4-乙烯基愈创木酚含量的方法。 

一种提高上面发酵小麦啤酒中4-乙烯基愈创木酚含量的方法，步骤如下： 

（1）从枯草芽孢杆菌中通过PCR扩增PADC基因，PADC基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，PCR扩增引物序列如下： 

上游引物：F-padc5’-GCGTCTAGAATGGAAAACTTTATCG-3’ 

下游引物：R-padc5’-GCGAAGCTTTTATAATCTTCCCGC-3’； 

（2）将步骤（1）制得的PADC基因经纯化后，经内切酶XbaI和内切酶HindIII双酶切后与同样经内切酶XbaI和内切酶HindIII双酶切的质粒YEp352连接，制得重组质粒YPADC，将重组质粒YPADC转化至上面发酵酵母W303-1A，获得上面发酵重组酵母菌株W303+padc； 

（3）利用11°P麦汁对步骤（2）制得的上面发酵重组酵母菌株W303+padc进行扩大培养，培养条件为：25～28℃摇床，220～240r/min，获得上面发酵酵母W303+padc； 

（4）将步骤（3）制得的上面发酵酵母W303+padc接种于11°P麦汁中，在温度为16～18℃进行发酵培养至糖度为4°P时，密封发酵容器保压至双乙酰含量低于0.1mg/L，降温至0～2℃，保存5～8天，制得4-乙烯基愈创木酚含量为1.6～1.8mg/L的啤酒。