[发明专利]人hcrcn81的原核重组质粒及其所表达的蛋白与兔抗人多克隆抗体及用途

说明书

技术领域

本发明涉及一种原核重组质粒及其所表达的蛋白与兔抗人多克隆抗体及用途。

背景技术

近年来, 恶性肿瘤对人类的威胁日益突出，肿瘤已成为死亡常见原因之一，严重影响着人类的健康。癌症是一种常见的恶性肿瘤，在其发生和发展过程中，已经发现一些致癌基因的激活（如survivin、c-myc、Bcl-2等）和抑癌基因的失活（如p53、DCC、nm23、APC、PTEN 、DPC4等），所述致癌基因和抑癌基因与人癌症的发生、发展有密切关系，但是至今还有许多的致癌基因、抑癌基因尚未发现。

人hcrcn81基因已在GenBank注册，注册号NM_001013649.3，定量荧光PCR显示，人hcrcn81基因的mRNA的表达在结直肠腺癌组织中下调，NM_001013649.3在肿瘤组织中的低表达可能导致相应蛋白在恶性肿瘤细胞中的低表达，从而导致相关癌基因的激活及抑癌基因的失活，hcrcn81可能与结直肠腺癌的发病有关（ 见Qin Jiang, Chunle Zhang, Yao Chen . NM_001013649.3 gene is down-regulated in human colorectal adenocarcinoma. Molecular Medicine Reports.2011;4(6):1279-1281）。因此，有必要进一步研究HCRCN81蛋白质在人恶性肿瘤中的作用。

抗体是在对抗原刺激的免疫应答中，B淋巴细胞产生的一类糖蛋白。它是能与相应抗原特异的结合，产生各种生理效应的球蛋白。多克隆抗体是人类有目的地利用抗体的第一步，其在生物医学等方面的应用已有上百年的发展历史。多克隆抗体能有效提高抗原摄取、加工和识别，因此，有必要制备新型多克隆抗体，为进一步研究hcrcn81基因的功能提供工具。

发明内容

本发明的目的是提供一种人hcrcn81的原核重组质粒、重组人HCRCN81蛋白质和兔抗人多克隆抗体，并证明所述兔抗人多克隆抗体可用于检测人癌细胞和人组织中HCRCN81蛋白质的表达，为研究hcrcn81基因在人癌症发生发展中的作用和地位提供有用的工具。

人hcrcn81基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所述。本发明所述原核重组质粒，由序列表中SEQ ID NO.1中的基因片段与原核表达载体构建而成，所述基因片段是SEQ ID NO.1中第73位至第573位的核苷酸序列，所述的基因片段正向插入原核表达载体。

本发明所述原核重组质粒，其原核表达载体为pET质粒系统，包括pET-28a 、pET-30a、pET-32a或 pET32a (+)。

本发明所述重组人HCRCN81蛋白质，由上述原核重组质粒表达而成，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所述。    

本发明所述兔抗人多克隆抗体，由上述重组人HCRCN81蛋白质免疫新西兰大耳白兔后收集抗血清纯化得到，其制备方法依次包括以下步骤：

（1）通过RT-PCR反应，获得人HCRCN81蛋白质编码基因，即序列表SEQ ID NO.1中第73位至第573位的核苷酸序列；

（2）将步骤（1）扩增的人HCRCN81蛋白质编码基因插入到原核表达载体构建原核重组质粒，再将所述原核重组质粒转化至感受态细菌中进行培养，然后筛选出含有正确插入片段的克隆；

（3）利用PCR扩增和限制性内切酶酶切图谱分析所述原核重组质粒，并进行DNA序列分析；

（4）将正确克隆的原核重组质粒转化工程菌中进行表达，分离纯化表达的蛋白即获得重组人HCRCN81蛋白质；

（5）采用SDS-PAGE、质谱分析鉴定重组人HCRCN81蛋白质的正确性；

（6）将所述重组人HCRCN81蛋白质免疫新西兰大耳白兔后收集抗血清；

（7）采用抗原亲和纯化方法从步骤（6）所收集的抗血清中获得兔抗人多克隆抗体(Anti-HCRCN81)。

本发明用雷帕霉素处理结肠癌细胞，并对处理之前和处理之后的结肠癌细胞所表达的总蛋白进行Western blot试验，验证所述兔抗人多克隆抗体(Anti-HCRCN81)对结肠癌细胞表达的HCRCN81蛋白的检测效果。

本发明提取人结直肠癌组织和正常结直肠组织的总蛋白，并对所提取的总蛋白进行Western blot试验，验证所述兔抗人多克隆抗体(Anti-HCRCN81)对人结直肠癌组织和正常结直肠组织所表达的HCRCN81蛋白的检测效果。