[发明专利]一种基于DNA三维纳米结构探针的电化学miRNA检测方法

说明书

技术领域

本发明属于核酸杂交检测领域，具体涉及一种基于DNA三维纳米结构探针的电化学miRNA检测方法。

背景技术

微小RNA（miRNAs）是一类新发现的长度为19-23个核苷酸的内源性非编码单链小分子RNA，通常在转录后水平调控细胞的增殖、分化、凋亡、代谢等过程。自从1993年Lee等最早在Caenorhabditis elegan中发现参与调控线虫时序发育的lin-4后，人们对研究这些小分子在动植物基本生命过程中的重要作用产生了极大兴趣。大量的研究表明异常的miRNAs表达水平与人类多种类型的癌症直接相关（Nature Reviews Cancer,2006,6,259-269），并且还发现血清和唾液中的miRNAs可以稳定存在而不被降解（Proc.Natl.Acad.Sci,2008,105,10513-10518），这些性质突显了miRNAs作为癌症早期诊断和无创诊断的标志物的价值和意义。

无论是基础生物学研究还是癌症的早期诊断和筛选都迫切需要定量检测miRNAs的方法，然而由于miRNAs在体内的含量极少，序列短，相似性高并且容易被环境中的RNA酶降解等难点使得miRNAs的检测一直面临很多的技术挑战。Northern blotting一直被公认为是miRNAs检测的标准方法，但是由于它操作繁琐，费时费力，灵敏度相对较低并且样品需要量大（10μg样品）等缺点使得它不适用于常规的临床诊断上。定量PCR（qPCR）和微芯片技术也是人们常用的miRNAs检测方法，但这些方法常常需要昂贵的仪器，复杂的操作，对miRNAs进行标记等，无法满足miRNAs床边检测（point-of-care tests,POCTs）的全部要求，例如不需要标记，不需要放大，在检测非常少的血清样品中miRNAs具有足够高的灵敏度和选择性，能够很好的区分miRNAs家族中1~2碱基的错配，廉价且便携适用于小型临床或者家庭诊断等。

电化学传感器被认为是最有希望实现POCT的器件，目前已经有一些廉价而且小体积的电化学检测器存在（如基于电化学原理的家用血糖仪）（Nat.Protoc.,2007.2，2888-2895；Nature Chemistry,2011.3，697-703）。但是电化学DNA传感器的灵敏度常常由于异相电极表面的传质过程减慢和表面拥挤效应的影响使探针分子与目标DNA或RNA分子之间很难接触而受限制。目前的电化学传感器检测miRNAs的灵敏度大多在pM-fM范围，无法在不进行PCR前处理情况下直接检测十分微量的miRNAs。

纳米结构表面的界面加工可以从热力学和动力学上大大改善分子间的识别能力，这一观点已经从理论和实验上都得到了证明（NatureNanotechnology,2009.4,844-848；Nature Biotechnology,2008.26,417-426）。随着DNA纳米技术的快速发展，人们已经可以高度可控地自下而上地组装精巧的DNA纳米结构。DNA纳米结构的界面工程在不需要借助工艺水平上的微加工技术就可以很方便的控制从溶液到空间立体结构的转变，并且能够增加表面探针与目标分子的接触机会。我们之前的研究也已经证明三维DNA纳米结构探针的三个顶点修饰巯基可以快速而又牢固地吸附到电极表面，形成有序、均相的DNA纳米结构自组装单分子层（SAM）用于生物传感研究（Adv.Mater.,2010，22，4754-4758）。

在此基础上，利用DNA三维纳米结构来进行DNA检测的方法也陆续出现，但是由于DNA和miRNA的结构和性质存在着巨大的差异，因此用于检测DNA的方法能否用于检测miRNA完全是无法预测的。例如专利申请（CN201010119941.9）公开了一种利用DNA三维纳米结构探针用于检测目标DNA的方法，其中，目标DNA、DNA三维纳米结构探针、DNA信号探针共同形成夹心结构，然后利用电化学检测进行定量分析。同样，由于miRNA序列非常短（22nt左右），与DNA探针进行杂交时的溶解温度（Tm）很低，因此不适用于形成夹心结构进行电化学检测。如果将待测的miRNA分成两段与DNA探针进行杂交，所涉及的Tm值会更低，常温下不稳定。因此，与形成夹心结构的检测方法相比，人们通常会选择与之截然不同的方法来对miRNA进行检测。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用DNA三维纳米结构探针的超灵敏的电化学miRNA的方法，解决了现有技术中的检测方法需要大量的目标miRNAs等缺点。