[发明专利]末端连接脯氨酸的聚乙二醇的酸或活性酯的制法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及聚乙二醇水溶性聚合物及其制备方法和应用，尤其涉及聚乙二醇活性酯及其制备方法和应用。

背景技术

使用化学方法将水溶性聚合物聚乙二醇（Polyethylene Glycol，PEG）结合到分子和表面在生物技术中具有重大的应用意义。PEG在生物技术领域有着广泛的应用：一些PEG的活性衍生物结合到蛋白质、酶的分子上，即对酶进行修饰，由于PEG可以溶于有机溶剂，PEG结合到酶分子可以使PEG与酶的结合物溶于有机溶剂；与未修饰的蛋白质相比，将PEG连接到蛋白质上可减小蛋白的免疫原性、降低肾脏排除速率，并可从中促使结合物在血液循环中的半衰期的增加；PEG结合到表面可减小蛋白质和细胞的吸附并改变表面的带电性质，PEG结合到脂质体上可以使其半衰期有极大增加，并能够增加其作为药物缓释的介质的能力。

PEG只有经过活化才能够结合到分子或表面上。因此，一系列的活化衍生物被制备出来。目前应用较广的修饰剂活化类型为羧酸的活化酯类。该类修饰剂是通过活化酯对蛋白的自由氨基进行酰化，从而将PEG链结合到蛋白质分子上实现修饰的。

目前，许多用于修饰的活化的羧基PEG具有较差的反应活性。例如，羧甲基化PEG（CM-PEG）的NHS酯的反应活性太强，以至溶解在水中立刻水解（在pH8、25°C下的水解半衰期为0.75 min），这种高反应活性是羧甲基化PEG活性酯的严重缺陷。而第一代修饰剂中活化的SC-PEG虽然有较好的反应活性（在pH8、25°C下的半衰期为20.4 min），但由于在分子内含有不稳定的酯键，现已较少使用。又如丁二酸酐丁二酰亚胺酯活化的PEG（succinimidyl succinate，SS-PEG）。SS-PEG的制备是通过mPEG与丁二酸酐发生酯化反应，使丁二酸酐开环，从而在PEG的链端造成一个羧基，然后又将羧基活化成丁二酰亚胺酯。该试剂在与蛋白质结合后还存在一个酯键，而酯键由于其固有的不稳定性在PEG高分子结合到蛋白质上时非常容易被水解。这种水解不仅会使PEG链从蛋白上脱落，丧失PEG修饰带来的益处，而且留在蛋白质上的丁二酸尾部还可作为半抗原导致蛋白质的免疫原性。Harris等人在mPEG的末端引入丙酸单位，使得这种丙酸PEG活性酯的水解半衰期增加到16.5分钟，但该方法涉及了在PEG一端引入氰基，需要再进行强酸和强碱的水解才能得到产物，极有可能破坏PEG主链。

目前，许多用于修饰的活化的羧基PEG具有很差的反应活性：不是反应太快就是反应太慢。例如，羧甲基化PEG（CM-PEG）的NHS酯的反应活性太强，以至溶解在水中立刻水解，这种高反应活性是羧甲基化PEG活性酯的严重缺陷。

发明内容

本发明需要解决的技术问题是公开一种末端连接脯氨酸的聚乙二醇的酸或活性酯的制法和应用，以克服现有技术存在的缺陷，满足医药领域和生物工程领域发展的需要。

本发明的末端连接脯氨酸的聚乙二醇的活性酸或酯的结构式如下：

R₁－(OCH₂CH₂)_n－O－R₂

其中n＝43~680；

R₁可以是CH₃－，也可以是R₂

R₂的结构如下：

R₃可以是H－，也可以是－N－丁二酰亚胺基。

本发明提供的连接脯氨酸的聚乙二醇的活性酯具有合适的反应活性，活性酯在水中的水解半衰期为10.9分钟，且不含有其它的酯键连接。

本发明的连接脯氨酸的聚乙二醇的活性酯的制备方法包括如下步骤：

（1）CM-PEG（羧甲基化聚乙二醇）的制备：

将聚乙二醇溶于甲苯中，加入叔丁醇钾回流反应1~2小时，加入溴乙酸乙酯回流反应2~4小时，然后室温反应18~24小时，浓缩后用乙醚沉淀，沉淀物碱水解然后酸化，采用常规的方法收集产物；

（2）脯氨酸乙酯盐酸盐的制备：

将氯化氢气体通入含有脯氨酸的乙醇直到饱和，然后收集脯氨酸乙酯盐酸盐；

（3）末端连接脯氨酸的聚乙二醇酸衍生物的制备：