[发明专利]一种FOX hunting蒙古柳农杆菌cDNA文库的构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及蒙古柳FOX hunting农杆菌cDNA文库的构建方法。 

背景技术

利用得到的大量拟南芥FL-cDNA（full-length cDNA）克隆，Ichikawa等人发展了一种选择性功能增加方式，系统阐明拟南芥基因功能——被称为FOX hunting system(全称Full-lengthcDNA Over-expressing gene hunting system)在2006年，首先作为一种技术被提出。这种方法通过在转基因植物中过量表达单个或有限数量的FL-cDNA，产生大量显性突变，可以根据新的重要特征，鉴定基因功能。这种技术的建立有重要的意义，为鉴定基因功能，几种系统和工具都是产生功能缺失突变而发展起来。 

目前，拟南芥FOX植株，水稻FOX拟南芥植株和FOX水稻植株都可以用来鉴定和探索植物基因的功能，结合使用这几种突变植株能更有效地分析基因的功能。因此，利用功能性技术，对植物的全长cDNA就可以进行基因功能分析。而现在，很多植物如大豆、小麦、柑橘和杨树等植物的全长cDNA克隆被收集。长期以来盐碱草源地区生长的乡土树种蒙古柳(Salixmongolica)。由于与其它柳树的居群不同，其生态学特性和表现型存在差异，植物的基因也具有多样性的特点，蒙古柳是盐碱地宝贵的生物基因资源，蒙古柳全长cDNA文库的研究还未见报道。 

发明内容

本发明提供了一种FOX hunting蒙古柳农杆菌cDNA文库的构建方法。 

本发明的一种FOX hunting蒙古柳农杆菌cDNA文库的构建方法是按照以下步骤进行的： 

一、采用异硫氰酸胍法提取蒙古柳的总RNA，然后采用试剂盒对提取的蒙古柳总RNA反转录成总cDNA； 

二、将步骤一反转录的总cDNA连接到pGEM-T载体上，构建出pGEM-cDNA，转化大肠杆菌JM109感受态细胞中，构建了pGEM-cDNA在大肠杆菌JM109中的文库； 

三、将步骤二得到的pGEM-cDNA和pBI121载体，采用AsiSI和AscI酶分别进行双酶切，然后将酶切后的目的片段与酶切后的pBI121载体进行连接，得到植物二元表达载体pBI121::cDNA； 

四、将步骤三得到的植物二元表达载体pBI121::cDNA，转化至大肠杆菌JM109感受态细胞中，构建出JM109菌株的pBI121::cDNA克隆文库，提取JM109菌株的pBI121::cDNA克隆文库的DNA； 

五、将步骤四得到的JM109菌株的pBI121::cDNA克隆文库的DNA通过电击转化导入根癌农杆菌EHA105菌株中，即完成蒙古柳FOX hunting农杆菌cDNA文库的构建。 

本发明包含以下有益效果： 

本发明对蒙古柳中抗逆性基因进行研究，筛选出目的基因，利用分子生物学的手段，从基因表达特性及转基因植物对逆境的应答性进行深入细致的研究，以期获得具有耐性的植物材料。本发明作为抗旱、耐盐碱基础理论研究的一部分，将为植物耐性分子育种奠定理论基础。研究的结果不但可以丰富植物的遗传、生理方面的理论基础，同时对沙化土地资源的高效利用、生态环境的建设等方面具有一定的作用。 

附图说明

图1为具体实施方式一中提取的蒙古柳嫩芽及根的总RNA的电泳图；其中，1为根的总RNA的电泳图，2为叶的总RNA的电泳图； 

图2为具体实施方式一中蒙古柳嫩芽及根的总RNA反转录成总cDNA的PCR鉴定结果电泳图；其中，1为总cDNA的电泳图，2为λDNA用HindIII酶切3小时后的电泳图； 

图3为具体实施方式一中蓝白斑筛选进行检测结果； 

图4为具体实施方式一中选取白斑进行PCR鉴定电泳结果图；其中，1为λDNA用HindIII酶切3小时后的电泳图，2为阴性对照； 

图5为具体实施方式一中选取白斑进行PCR鉴定电泳结果图； 

图6为具体实施方式一中pBI121载体酶切检测电泳图；其中，1为λDNA用HindIII酶切3小时后的电泳图，2为pBI121载体酶切后的电泳图； 

图7为具体实施方式一中蒙古柳cDNA表达载体的构建示意图； 

图8为具体实施方式一中蒙古柳pBI121::cDNA载体的JM109克隆文库的PCR检测结果电泳图；其中1为λDNA用Hind III酶切3小时后的电泳图，2为阳性对照；