[发明专利]一种减弱反馈抑制菌株生产谷胱甘肽的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体地说，是关于一株用减弱了反馈抑制的菌株提高谷胱甘肽累积量的方法。

背景技术

谷胱甘肽(γ-L-glutamyl-cysteinyl-glycine，GSH)，是由L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸组成的生物活性三肽化合物，是细胞内重要的抗氧化剂和主要的非蛋白巯基化合物(＞90％)。在生物组织中，谷胱甘肽通过谷胱甘肽还原酶保持氧化型和还原型的动态平衡并发挥细胞保护、物质代谢、信息调控、调节细胞及组织的发育、对抗或诱发疾病等作用，因此，大量应用于医药保健、护肤美容、食品添加等行业。对于谷胱甘肽的生产，经历了萃取法、化学合成法、酶催化法和发酵法，其中发酵法已成为生产谷胱甘肽的主要方法。基于发酵法的菌株选育和条件优化等生产方法的应用也使谷胱甘肽的生产得到了提高并广泛在实验室规模上加以实验，但应用于实践的却不多，究其原因，主要是谷胱甘肽合成过程中的限速酶，γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶容易受到终产物谷胱甘肽的反馈抑制，当终产物浓度达到一定程度后就会反馈抑制γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的活性，使产量维持在较低的水平。

多年来，科研工作者们用了很多方法试图通过减弱反馈抑制的方法来提高目的产物的产量，如Murata等人早期成功构建了具有较强GSH合成能力的重组E.coli并从E.coliB中筛选得到一株GSH1脱敏突变株，克隆了其GSH1基因并在E.coli B RC912中得以表达，获得的菌株合成GSH的能力大大提高。Liang与Zhao等人通过在培养基中添加表面活性剂和制霉素的方法抑制细胞膜的合成，使产物及时的分泌出来，减弱了反馈抑制，提高了产量。但这些操作都是基于提高酶系的活力或降低酶系对GSH的敏感性，没从本质上消除反馈抑制。况且，一些表面活性剂的加入会对细胞产生一定的毒性。因此，寻求新的方法减弱或者消除反馈抑制以从根本上提高目的产物的产量显得尤为重要。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种谷胱甘肽合成酶系重组质粒，以用于构建表达谷胱甘肽合成酶系的菌株。

本发明还有一个目的在于，提供一种谷胱甘肽合成酶系重组质粒的构建方法。

本发明还有一个目的在于，提供一种谷胱甘肽合成酶系重组质粒的应用。

本发明还有一个目的在于，提供一种减弱反馈抑制菌株生产谷胱甘肽的方法。

本发明提供的谷胱甘肽合成酶系重组质粒包括GSH1和GSH2序列和两个合适的载体片段；所述GSH1和GSH2序列分别如NCBI上Gene ID为242378250和253978924的序列所示。

根据本发明的一个优选实施例，在谷胱甘肽合成酶系重组质粒中，GSH1和GSH2分别连接在不同的载体上，根据两个载体启动子的不同调控两个基因表达的时间，从而使GSH1和GSH2分开表达，进而使合成γ-谷氨酰半胱氨酸(谷胱甘肽合成过程中的中间产物，由γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶催化合成)和谷胱甘肽分步进行，消除反馈抑制。

根据本发明的另一个优选实施例，所述谷胱甘肽合成酶系重组质粒分别包括一个卡那霉素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因，用以筛选基因重组菌。

本发明提供的谷胱甘肽合成酶系重组质粒的构建方法包括以下步骤：

A)PCR扩增获得GSH1和GSH2序列；

B)将GSH1和GSH2序列分别克隆入pET28a和pBAD24。

本发明提供的谷胱甘肽合成酶系重组质粒可用于构建表达谷胱甘肽合成酶系的菌株。

本发明提供的方法可用于累积谷胱甘肽。

本发明提供的累积谷胱甘肽的方法通过发酵培养本发明提供的谷胱甘肽合成酶系重组菌株，累积谷胱甘肽。

根据本发明的另一个优选实施例，累积谷胱甘肽的方法还通过，在选择高产菌株后，通过高密度发酵的技术来累积谷胱甘肽。

使用本发明提供的双质粒可以构建累积谷胱甘肽大肠杆菌，可以明显的减弱反馈抑制，提高了谷胱甘肽生产量，提高了原料利用率、降低了成本和能耗，可为进一步研究生物法合成谷胱甘肽建立一个基础模型。除此之外，该方法构建的菌株及思路可以用于其他因反馈抑制限制产量提高的目的产物，为生产有价值的产品提供了新的思路。

附图说明

图1是PCR扩增获得的GSH1的检测结果，其中泳道1为GSH1。

图2是PCR扩增获得的GSH2的检测结果，其中泳道1为GSH2。