[发明专利]一种大菱鲆C型溶菌酶及其构建和应用

说明书

技术领域

本发明涉及分子微生物学领域，具体的说是一种大菱鲆C型溶菌酶及其构建和应用。

背景技术

溶菌酶（lysozyme），又称为胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶，它能降解细菌细胞壁中N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，从而破坏细胞壁，使得胞内容物释放，由此导致细菌死亡。根据其序列结构特点，溶菌酶可分为六大类，其中C型溶菌酶(C-type lysozyme)在动物中是一种主要类群，广泛存在哺乳动物、鸟类、鱼类等。溶菌酶是一种重要的天然免疫因子，在抗病原感染过程中发挥重要作用，因此在临床上，溶菌酶用于抗细菌和病毒感染以及消肿止痛等。另外，溶菌酶在食品工业中被用作防腐剂。

发明内容

本发明目的在于提供一种大菱鲆C型溶菌酶及其构建和应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种大菱鲆C型溶菌酶，溶菌酶为序列表SEQ ID No.1中的氨基酸序列所示。

大菱鲆C型溶菌酶的制备方法，

1）菌株BL21/pSmLysC的构建：

以大菱鲆cDNA为模板，用引物F1和R1进行PCR扩增，PCR产物纯化后与载体pEASY-E2于室温连接2－8小时，连接混合液转化大肠杆菌BL21(DE3),筛选转化子，即为BL21/pSmLysC；所述F1为5’-GATATCATGAAAGTCTTCGAACGCTGT-3’，R1为5’-GATATCCACACCACATCCTGCCAC-3’；

2）溶菌酶的表达和制备

将上述步骤1）的BL21/pSmLysC在含有安卡青霉素的LB培养基上培养至OD₆₀₀为0.5,加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷使其终浓度达到1mM，28℃继续摇动培养5－6小时，而后用亲和层析柱纯化重组蛋白，即为SEQ IDNo.1中氨基酸序列所示。

大菱鲆C型溶菌酶的应用，所述溶菌酶可作为革兰氏阳性菌的抑菌剂。所述革兰氏阳性菌为藤黄微球菌（Micrococcus luteus）、海豚链球菌（Strep tococcus iniae）或金黄色葡萄球菌（Staphyl ococcus aureus）。

本发明具有如下优点：本发明的溶菌酶可以有效裂解多种革兰氏阳性菌，因而可以用于防控革兰氏阳性菌相关疾病。

附图说明

图1为本发明实施例纯化得到的溶菌酶电泳图谱（其中，纯化得到的溶菌酶为泳道2；泳道1：分子量marker。）。

图2为本发明实施例溶菌酶的杀菌效应例图（其中，图A为本发明实施例制备的溶菌酶产生的抑菌圈；图B为PBS阴性对照）。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。

在本发明实施例中所涉及到的常规性实验方法均采用如下方法：

1.质粒提取、DNA(PCR)产物纯化、DNA片段从凝胶中回收皆使用“天根生化科技(北京)有限公司”的相应试剂盒。

2.大肠杆菌用Hanahan方法（Sambrook and Russell:Molecular Cloning:A Laboratory Mannual.Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001）；酵母转化按Invitrogen公司的方法（Catalog no.V175-20）；聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）按照Sambrook and Russell:Molecular Cloning:A Laboratory Mannual.Cold Spring Harbor Laboratory Press2001。

3.所有限制性内切酶和连接酶皆购自于“纽英伦生物技术有限公司”，北京。

实施例1

本发明的溶菌酶为序列表SEQ ID No.1中的氨基酸序列。

序列表SEQ ID No.1为：

MRCLLLLLLVPVPGAKVFERCEWARLLKRNGMSNYRGISLADWVCLSQWESSYNTRATNRNTDGSTDYGIFQINSRWWCDNGQTPTSNACGISCSALLTDDVGAAIICAKHVVRDPNGIGAWVAWKRHCQGQDLSSYVAGCGV

（a）序列特征：

●长度：143

●类型：氨基酸序列