[发明专利]一种重组热带假丝酵母生产木糖醇的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种重组热带假丝酵母工程菌的构建及其在全细胞法生产木糖醇中的应用。 

背景技术

木糖醇(英文名：xylitol，化学名称：1,2,3,4,5-pentahydroxypetane)，又称戊五醇。木糖醇作为木糖代谢的中间产物之一，是一种天然存在的五碳糖醇。木糖醇是一种高甜度低热量的天然植物甜味剂，是一种高附加值的多元醇。木糖醇具有非致龋性，其在体内代谢不依赖胰岛素，并具有保肝护肝的作用，被广泛应用于口腔卫生、医药产品、食品添加剂等工业领域中。 

目前已商品化的木糖醇生产都是采用化学转化法。先将来源于不同生物质原料的半纤维素经酸或碱水解处理，使其中的多缩戊糖水解为D-木糖，然后经过复杂的脱毒、脱色等工序去除有害杂质，再在镍催化剂作用下将水解液中的木糖进行加氢还原获得木糖醇。化学法生产木糖醇产量低，在生产过程中需要高温高压，最后的催化液中成分复杂，木糖醇的提取纯化比较困难。整个木糖醇生产工艺复杂，能耗高、污水排放量高，生产成本高，严重限制了木糖醇的生产和应用。 

微生物转化生产木糖醇条件温和，而且具有专一性好、转化效率高、成本较低等优点，是替代化学法生产的理想途径。一般来说，酵母被认为是最好的木糖醇转化微生物。目前用于生产木糖醇的酵母菌株包括能够代谢木糖的天然酵母菌，以及利用树干毕赤氏酵母(Pichiastipitis)的木糖还原酶基因(XYL1)构建的重组酿酒酵母菌。这些酵母菌株转化生产木糖醇时，其底物木糖仍要通过硫酸或碱水解半纤维素原料获得，工艺过程仍需排放大量废水，受到国家环保指标的严格限制。同时，硫酸或碱水解半纤维素原料获得的水解液中，往往含有苯酚、糠醛等毒性物质及其他抗营养因子，对酵母细胞的生长具有极大的毒害作用，进而影响菌株发酵生产木糖醇的能力。 

因此，直接以半纤维素原料为底物，采用全细胞法清洁生产木糖醇成为未来木糖醇工业发展的必然趋势，能够解决半生物合成法的高能耗、高排污的行业问题，以实现过程的节能减排，推动生物质资源利用整体技术进步。 

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种利用重组热带假丝酵母全细胞法生产木糖醇的方法。 

为实现上述目的，本发明的技术方案是提供一种重组热带假丝酵母工程菌株，分别克隆 木聚糖酶(XYN)和木糖苷酶(XYL)编码基因，利用分子生物学技术将这两条基因片段的完整表达盒导入酵母表达载体pAUR123中，构建重组质粒pAUR123-xyn-xyl后转入木糖利用型热带假丝酵母(Candida tropicalis)中得到工程菌株。本发明的重组热带假丝酵母菌株C.tropicalis PNL能共表达木聚糖酶和木糖苷酶，这两种酶均为胞外分泌型，活性高。该重组菌能直接利用玉米芯半纤维素为底物，实现全细胞法生产木糖醇，减少了环境污染。 

所述重组的热带假丝酵母菌株C.tropicalis PNL在全细胞法生产木糖醇中的应用。 

(1)菌体种子液的制备：在摇瓶中按10-50%的装液量加入种子培养基，所用种子培养基配方为：木糖(5-50gL)、蛋白胨(1-10gL)、酵母膏(1-10g/L)、K₂HPO₄(1-5g/L)、MgSO₄·7H₂O(0.1-0.5g/L)、CaCl₂(0.1-0.5g/L)，pH4.5-6.5，在100-130℃下灭菌10-30min后，在无菌条件下从活化平板上挑取C.tropicalis PNL单菌落接入上述摇瓶中，培养温度为30-40℃，摇床转速为150-300rpm，培养时间为12-30h，得到菌体种子液备用。 

优选的，种子培养基木糖含量为5-25gL，蛋白胨含量为3-8gL，酵母膏含量为2-6gL，K₂HPO₄含量为1-3g/L，MgSO₄·7H₂O含量为0.1-0.3g/L，CaCl₂含量为0.1-0.3g/L，pH4.5-5.5。 

优选的，种子培养基装液量为15-35%。 

优选的，培养温度为32-38℃。 

优选的，摇床转速为160-200rpm。