[发明专利]抑藻活性物质二异丁氧基苯基胺的制备方法

权利要求书

1.抑藻活性物质二异丁氧基苯基胺的制备方法，其特征在于所述二异丁氧基苯基胺的分子式为C₁₀H₁₅NO；

所述抑藻活性物质二异丁氧基苯基胺的制备方法，包括以下步骤：

1）将短杆菌（Brevibacterium sp.）BS01纯化后接种于新鲜海水配制的固体培养基平板上培养；挑取所述固体培养基平板上的单菌落接种于新鲜海水配制的液体培养基中培养，得到发酵液；所述短杆菌（Brevibacterium sp.）BS01保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，登记入册编号为CGMCC No.6481；

2）将步骤1）所得的发酵液离心后加入萃取剂萃取，将乙酸乙酯萃取相合并得到萃取物A，将萃取物A旋转蒸干，再加入甲醇溶解离心，去盐，去蛋白，得到粗提物A；

3）将步骤2）所得的粗提物A溶于萃取剂中，然后上样于硅胶柱，采用流动相梯度浓度洗脱，在洗脱过程中，间隔收集洗脱液，并将洗脱液进行层析，采用紫外显色、碘蒸气显色和硫酸铵乙醇显色，然后合并相似组分，得到合并洗脱液；

4）将在步骤3）所得的合并洗脱液置于旋转蒸发仪下真空蒸干，然后溶解于DMSO进行抑藻活性验证，选取经验证后具有抑藻活性组分的粗提物B；

5）将步骤4）所得的粗提物B采用葡聚糖凝胶柱进一步分离，得到洗脱液；

6）将步骤5）得到的洗脱液进行层析分析，采用紫外显色、碘蒸气显色和硫酸铵乙醇显色，然后合并相似组分，得到合并洗脱液，然后将合并洗脱液置于旋转蒸发仪真空蒸干，再溶解于DMSO验证抑藻活性，选取经验证后具有抑藻活性组分的活性物C；

7）将步骤6）所得的活性物C，经薄层层析（thin-layer chromatography，TLC）分析检测，并经¹H-NMR质谱检测，得到纯化合物，该纯化合物即为本发明所述的抑藻活性物质二异丁氧基苯基胺。

2.如权利要求1所述的抑藻活性物质二异丁氧基苯基胺的制备方法，其特征在于在步骤1）中，所述固体培养基平板上培养是置于恒温培养箱中培养；所述恒温培养箱的温度为25～32℃；所述液体培养基中培养可通过摇床培养3～5d，所述摇床的温度可为28～37℃，所述摇床的转速可为180～250rpm。

3.如权利要求1所述的抑藻活性物质二异丁氧基苯基胺的制备方法，其特征在于在步骤1）中，所述固体培养基采用2216E固体培养基；所述液体培养基采用2216E液体培养基。

4.如权利要求1所述的抑藻活性物质二异丁氧基苯基胺的制备方法，其特征在于在步骤2）中，所述离心采用离心机离心，离心力为10,000～12,000g，离心时间为10～20min；所述萃取剂的加入量按体积比可与发酵液等体积。

5.如权利要求1所述的抑藻活性物质二异丁氧基苯基胺的制备方法，其特征在于在步骤2）中，所述萃取剂采用乙酸乙酯，所述萃取的次数可为5次；所述旋转蒸干可采用旋转蒸发仪旋转蒸干。

6.如权利要求1所述的抑藻活性物质二异丁氧基苯基胺的制备方法，其特征在于在步骤3）中，所述萃取剂采用乙酸乙酯；所述硅胶柱的规格为170×30mm，200～300目。

7.如权利要求1所述的抑藻活性物质二异丁氧基苯基胺的制备方法，其特征在于在步骤3）中，所述流动相梯度浓度洗脱最好依次经过以下（a）～（h）8个洗脱过程：（a）采用石油醚洗脱2～2.5个柱体积；（b）采用石油醚和乙酸乙酯洗脱，按体积比，石油醚∶乙酸乙酯=4∶0.5，总体积1.5个柱体积；（c）采用石油醚和乙酸乙酯洗脱，按体积比，石油醚∶乙酸乙酯=4∶1.5，总体积1.5个柱体积；（d）采用石油醚和乙酸乙酯洗脱，按体积比，石油醚∶乙酸乙酯=4∶2.5,总体积1.5个柱体积；（e）采用石油醚和乙酸乙酯洗脱，按体积比，石油醚∶乙酸乙酯=4∶3.5,总体积1.5个柱体积；（f）采用乙酸乙酯洗脱1.5个柱体积；（g）乙酸乙酯甲醇洗脱，按体积比，乙酸乙酯∶甲醇=25∶1，总体积2个柱体积；（h）采用甲醇洗脱2个柱体积；所述间隔收集洗脱液的间隔时间可为10～15min；所述层析可采用薄层层析分析方法进行层析。

8.如权利要求1所述的抑藻活性物质二异丁氧基苯基胺的制备方法，其特征在于在步骤4）中，所述旋转蒸发仪真空蒸干的温度为28～32℃。