[发明专利]一种糖化血红蛋白的核酸适体及其制备方法

权利要求书

1.一种糖化血红蛋白核酸适体，其特征在于，所述核酸适体的核苷酸序列包括有SEQ ID NO:1~SEQ ID NO:4中的任意一条DNA片段序列，其序列为：

SEQ ID NO:1：gggaggcatg tgtgctaagg cgtagcaggg ttggaaccc；

SEQ ID NO:2：gggaggcatg tgatttaagg cgcggcagat gttggaaccc；

SEQ ID NO:3：gggaggcatg agacctatgg cgttgcattg gttggaaccc；

SEQ ID NO:4：gggaggcatg ggaaacaatg cgccgcagag ttggaaccc。

2.一种制备权利要求1任一所述糖化血红蛋白核酸适体的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）构建随机序列寡核苷酸库：人工合成单链DNA序列，构建库容量为10⁵~10⁶的单链DNA随机序列寡核苷酸库，单链DNA随机寡核苷酸库包括的DNA序列为：

    5’-GACCATACCAGCTTATTCAATT-N_25~60-AGATAGTAAGTGCAATCTGGC-3’

所述单链DNA随机寡核苷酸库的DNA序列包括中间随机序列N_25~60和两端固定序列，所述中间随机序列N_25~60为25~60个碱基的随机序列，所述两端固定序列为：5’-GACCATACCAGCTTATTCAATT，3’-CGGTCTAACGTGAATGATAGA，所述两端固定序列为PCR扩增引物结合区；

（2）制备糖化血红蛋白-微磁珠复合物：将有活化氨基的微磁珠与糖化血红蛋白按照0.05~0.2ml:1mg的比例在偶联缓冲液中混合，再加入100~200ul偶联剂溶液，25oC反应条件下轻混20~30小时，使糖化血红蛋白C末端共价连接到微磁珠上，在分离装置中用清洗液洗涤得到糖化血红蛋白-微磁珠复合物；

（3）初次筛选靶物质-核酸复合物：将2~5nmol单链DNA随机序列寡核苷酸库溶于结合缓冲液，进行加热处理，单链DNA文库与没有结合糖化血红蛋白的磁珠孵育后，收集不结合磁珠的DNA随机寡核苷酸库的液体；将步骤2）糖化血红蛋白-微磁珠复合物与热处理后收集不结合磁珠的DNA随机寡核苷酸库在结合缓冲液中37oC温育15~40min，用洗脱缓冲液洗涤糖化血红蛋白-寡核苷酸-微磁珠复合物，除去不与糖化血红蛋白结合的和非特异结合的寡核苷酸序列，糖化血红蛋白-寡核苷酸-微磁珠复合物在洗脱缓冲液中92oC孵育5min后，回收带有单链寡核苷酸序列的洗脱缓冲液；

（4）制备次级单链DNA寡核苷酸库：将步骤3）中回收得到带有单链寡核苷酸序列的洗脱缓冲液进行PCR扩增，PCR扩增产物以链霉亲和素微磁珠为基质进行分离，经过碱变性解链，过滤，纯化，获得次级单链DNA寡核苷酸库，用于下一轮筛选；

（5）筛选并鉴定糖化血红蛋白核酸适体：将步骤4）所得的次级单链DNA寡核苷酸库经过12~20轮链霉亲和素微磁珠为基质分离筛选，获得目标寡核酸序列，克隆并测序所述目标寡核酸序列,通过酶联核酸适体吸附测定法鉴定其与糖化血红蛋白结合的特异性和亲和力。

3.根据权利要求2所述的一种制备糖化血红蛋白核酸适体的方法，其特征在于：所述的PCR扩增用到的PCR引物序列为：

    引物1：5’-ATACCAGCTTATTCAATT-3’

    引物2：5’-Biotin-AGATTGCACTTACTATCT-3’

所述的PCR扩增引物2的5’端含生物素标记；

所述PCR扩增工艺条件为：94oC预变性5 min，94oC 30s，47oC 1min，72oC 1min, 扩增10~25个循环，最终延伸反应为72oC 10min。