[发明专利]一种糖化血红蛋白的核酸适体及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于蛋白检测技术领域，涉及一种核酸，特别是涉及高特异性和高亲和力的糖化血红蛋白GHb的核酸适体及其制备方法。

背景技术

糖尿病是人类健康的世界性公共卫生问题，糖尿病是一种终生性疾病，其并发症是至残至死的主要原因，所以人们希望能尽早发现和治疗糖尿病。传统的糖尿病诊断和治疗监测采用空腹血糖、餐后血糖和口服葡萄糖耐量试验等，但是血糖参数仅代表抽血时的瞬间血糖水平，而糖化血红蛋白( GHb)作为反映长期血糖水平的金标准，也是监测糖尿病治疗的重要指标。GHb是红细胞中血红蛋白与葡萄糖缓慢、持续且不可逆地进行非酶促蛋白糖化反应的产物。形成两周后不易分开。当血液中葡萄糖浓度较高时，人体所形成的GHb含量也会相对较高. 正常生理条件下，非酶促糖化反应产物的生成量与反应物的浓度成正比。由于蛋白质浓度保持相对稳定，糖化水平主要决定于葡萄糖浓度，也与蛋白质与葡萄糖接触的时间长短有关。GHb可以反映最近2~3个月的平均血糖水平。2002年美国糖尿病协会已明确规定应定期检测GHb，并将其作为监测糖尿病血糖控制的金标。普及糖尿病知识，更新治疗理念，监测并保持GHb达标，更早、更合理地使用胰岛素等药物治疗，对于控制糖尿病并发症的发生发展尤为重要。

目前常用的糖化血红蛋白的检测方法有两大类：高压液相方法(HPLC)和免疫方法。高压液相方法(HPLC)所使用的仪器昂贵，难以在比较基层的医院和实验室普及；微柱法手工操作步骤繁琐，层析时间和微柱的质量不易控制，易产生操作技术误差，重复性欠佳；而且干扰因素很多，尤其对pH值和温度的变化敏感，HbF及变异血红蛋白(HbS、HbC、HbE等)对结果干扰，干扰程度根据柱的分离能力而定，且要仔细观察图谱，所以该法得不到普遍采用。免疫法测定糖化血红蛋白其准确性和重复性均有欠缺，测定受高浓度葡萄糖、高三酰甘油、高胆红素等物质的干扰，由于样本的浊度会使光度计测定产生错误。另外，抗体由动物免疫获得，成本高且筛选周期长，批与批之间存在差异；抗体对温度湿度敏感，易变性难保存等缺点，也得不到广泛使用。

核酸适配体是近年发展起来的一类新型识别分子，近年来受到科学家的广泛关注，大量针对重要生理活性分子的核酸适配体被筛选出来；各种基于核酸适配体的分析方法和技术已被报道；核酸适配体药物“Macugen”也已于2005年被FDA正式批准上市。SELEX技术筛选得到的寡核苷酸序列被称为适配子, 国内其翻译为核酸适体、核酸适配子、核酸识体或核酸适配体等。SELEX技术是指应用化学法合成大容量的随机寡核苷酸(由两端的固定序列和中间的随机序列组成)文库,通过施加选择压力(结合靶目标，淘选与靶目标高度特异结合片段的过程), 并结合体外扩增技术, 经过多轮的循环选择富集, 获得与靶物质高度特异结合的寡核苷酸分子, 可以是RNA 也可以是DNA, 长度一般为25~60个核苷酸。

核酸适体与靶物质结合所呈现的高敏感性和高特异性, 使其在疾病诊断中具有良好的应用前景, 尽管目前成熟的临床应用报道较少, 但应用适体检测靶蛋白的研究却不断增多, 基于适体的检测新技术也不断出现。专利CN201010580661.8，名称为蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2的核酸适体及其制备方法，公布了蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2的核酸适体的序列特征，通过设计合成单链DNA随机寡核苷酸库、筛选目的寡核苷酸序列、流式分析鉴定等步骤制备出蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2的核酸适体。专利CN201110148431.9和专利CN201110148603.2，公布了HCV E1E2蛋白的和HCV NS5A蛋白核酸适体及其衍生物、筛选方法和应用，其中核苷酸适体衍生物包括取代后的RNA核酸适体、骨架改造后的衍生物、改造为肽核酸后的衍生物以及连接上放射性分子后的衍生物。专利 CN201210214996.7，公布了可用于检测肌红蛋白的核酸适体、筛选用微流控芯片及其筛选方法和应用，公开了一种用前述微流控芯片筛选所述核酸适体的筛选方法，包括优化核酸文库、初筛、纯化、循环几个主要步骤，该发明的检测方法具有高亲和力和高特异性的优点。

由上可知，核酸适体由于其独特的化学抗体特性成为新一代针对特定蛋白的分子药物或靶向载体，以及用于检测其特异性识别的靶分子物质。但是目前基于核酸适体的针对于糖化血红蛋白GHb的高效特异性识别研究还很缺乏，且针对于糖化血红蛋白GHb的核酸适体及其筛选制备方法尚未见有报道。

发明内容