[发明专利]一种在酵母中重组表达生产人胸腺肽的方法

权利要求书

1.一种编码人血清白蛋白-人胸腺肽融合蛋白的融合基因，所述融合基因具有形如A-X-C结构的基因序列,其中A部分为编码成熟人血清白蛋白N-端1-150～1-372位氨基酸的核苷酸序列，X为编码包含肠激酶或烟草蚀纹病毒（TEV）蛋白酶切位点的连接肽的核苷酸序列，C为人胸腺肽基因。

2.根据权利要求1所述的融合基因，其特征在于：所述融合基因中，A部分为编码成熟人血清白蛋白N-端1-150～1-372位氨基酸的核苷酸序列。

3.根据权利要求1所述的融合基因，其特征在于：所述融合基因具有如SEQ IDNo.15或SEQ ID No.17所示的核苷酸序列。

4.根据权利要求1-3任一项权利要求所述的融合基因编码的人血清白蛋白-人胸腺肽融合蛋白。

5.根据权利要求4所述的人血清白蛋白-人胸腺肽融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白具有如SEQ ID No.16或SEQ ID No.18所示的氨基酸序列。

6.携带有如权利要求1-5任一项所述基因序列的载体。

7.一种生产人胸腺肽的方法，所述方法包括如下步骤：

（1）、在保持各自基因密码子阅读框架不变的前提下，在编码人血清白蛋白部分基因序列和人胸腺肽基因的两侧引入限制性内切酶识别位点，然后通过酶切操作形成具有如下结构的融合基因序列：A-X-C,其中A部分为编码成熟人血清白蛋白N-端1-150～1-372位氨基酸的核苷酸序列，X为编码包含肠激酶或烟草蚀纹病毒（TEV）蛋白酶切位点的连接肽的核苷酸序列，C为人胸腺肽基因；

（2）、将上述的A-X-C融合基因序列连接到表达载体，将表达载体转化导入酵母菌中，经筛选得到重组基因工程菌；

（3）、高密度发酵重组酵母菌，经诱导表达获得可溶性的人血清白蛋白-胸腺肽融合蛋白，加入肠激酶或烟草蚀纹病毒（TEV）蛋白酶切，经分离纯化获得重组人胸腺肽。

8.根据权利要求7述的方法，其特征在于：所述方法步骤（1）中，融合基因C部分的人胸腺肽基因为人胸腺肽α、β或γ型基因。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述方法步骤（1）中，在人胸腺肽基因两侧引入限制性酶切位点，构建如B-X-C-D结构的基因序列,其中B和D为限制性酶切位点，X为编码包含肠激酶(EK)或烟草蚀纹病毒（TEV）蛋白酶切位点的连接肽的核苷酸序列，C为人胸腺肽基因。

10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述方法步骤（2）中，所述的载体选自酵母表达载体pPICZ-α-A、pHIL-D₂、pPIC9或pHIL-S₁，动物细胞表达载体pSVK3或pMSG。