[发明专利]微波消解-ICP-MS法直接测定海产品中有机硒、蛋白硒或多糖硒的检测方法

权利要求书

1.微波消解-ICP-MS法直接测定海产品中有机硒、蛋白硒或多糖硒的检测方法，其特征在于该方法包括以下的步骤：

样品的制备

将样品去壳，所有可食部分用打浆机充分搅碎和混匀，装入样品袋，在-18℃贮存备用；

（一）有机硒的分离纯化

采用持续透析法，准确称取20.0g试料装入透析袋中，在超纯水中透析96h，每隔12h换一次水；透析完成后的试料经真空冷冻干燥，在-18℃贮存备用；

（二）硒蛋白的分离纯化

1）准确称取20.0g试料至烧杯中，加入120mL丙酮，放在磁力搅拌器上搅拌脱脂4h，8500r/min离心15min，弃上清液；

2）挥干丙酮后，加入600mL 0.25mol/L NaOH溶液，50℃水浴搅拌提取4h，过滤，得到上清液；

3）滤渣加入200mL 0.25mol/L NaOH溶液反复提取2次，合并滤液，加入硫酸铵至饱和度为95%，4℃静置12h；

4）8000r/min离心25min，沉淀以50mL50mmol/L 三羟甲基氨基甲烷-HCl缓冲液，pH8.0，溶解；

5）4℃下依次用50mmol/L 三羟甲基氨基甲烷-HCl缓冲液、超纯水透析至BaCl₂溶液检测透析液中无SO₄^2-析出；

6）透析完成后的试料经真空冷冻干燥，在-18℃贮存，用于硒含量分析；

（三)硒多糖的分离纯化

1）粗多糖提取：准确称取20.0g试料至烧杯中，脱脂后，加入500mL去离子水，70℃水浴浸提5h，8500r/min离心15min，收集上清液；加入3倍体积95%乙醇，4℃静置过夜，离心收集沉淀；沉淀用去离子水复溶，冷冻干燥得到粗多糖；

2）脱蛋白：采用胰蛋白酶+Sevag法脱蛋白，调节pH至6.5，添加4%粗多糖的胰蛋白酶，60℃孵育6h；100℃沸水加热5min灭活；离心取上清液，加入1/3氯仿-正丁醇，体积比为4:1，充分摇晃30min，静置分层，收集上层糖液，重复多次直至中间层无变性蛋白析出；糖液用3倍体积95%乙醇，4℃静置过夜，得多糖沉淀，离心后将多糖沉淀用85%乙醇洗涤3次，真空冷冻干燥得到多糖，用于硒含量分析；

二、硒含量的测定

（一）微波消解

分别准确称取0.2g，试料或提取获得的有机硒、硒蛋白或硒多糖，加入5mL HNO3和2mL H2O2，放入微波消解仪进行微波消解，样品消解完成后，冷却至室温，将消解液转移至100mL容量瓶中，分别加入1 μg/mL72Ge和89Y双内标使用溶液40μL，用水定容至刻度，摇匀，待测；

微波消解程序如下：功率1200W，步骤1, 120℃，升温5min，保持5min；步骤2, 180℃，升温15min，保持10min；

（二）空白试验

按照二中（一）方法处理没有与待测样品接触的试剂；

（三）电感耦合等离子体质谱测定

电感耦合等离子体质谱测定条件如下：

1) RF发射功率：1.30KW；

2) 冷却气流量：13.0L/min；

3) 雾化气流量：0.81L/min；

4) 辅助气流量：0.78L/min；

5) 雾化器：同心雾化器；

6) 雾化室温度：3 ℃；

7) 采样锥/截取锥：Nickel；

8) 四极杆偏压：-13.00 V；

9) 六极杆偏压：-11 V；

10) 采样深度：120 mm；

11) 碰撞气（7%H2:93%He）：6 mL/min；

12) 采样模式：全定量；

13) 扫描方式：跳峰；

14) 积分时间：15 ms； 

15) 测量点数: 3；

16) 提升量: 1 mL/min；

17) 监控质量数: 80。