[发明专利]β-糖苷酶突变体及其编码基因与其在生产人参皂苷CK中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种β-糖苷酶突变体及其编码基因与其在生产人参皂苷CK中的应用。

背景技术

人参是传统的中医药材。据现代药理研究报道，人参具有增强人体免疫力，改善营养、抗衰老和减缓疲劳等功效。人参皂苷CK作为人参的主要有效活性成分之一，更易于被人体吸收，且具有促进恶性肿瘤细胞衰亡、遏制肿瘤扩散或恶化等医疗功效，因此具有极高的生产价值和应用前景。然而，人参皂苷CK在天然的人参提取物中并不存在，而是由其它人参皂苷成分（如人参皂苷Rb₁,Rb₂,Rd,Re和Rg₁等）经由肠道菌代谢转化生成，因此在自然界中含量非常低。人参皂苷的转化过程主要包括将葡萄糖等单糖基团从主体结构水解除去，水解的方法有化学水解法和生物催化反应法等。化学方法虽然转化效率较高，但催化缺乏专一性，从而限制了其广泛的应用。而生物催化反应法，利用酶法实现人参皂苷CK合成的研究比较少，主要是真菌来源的一些酶蛋白的纯化和性质研究，如纯化自Paecilomyces Bainier的葡糖苷酶，纯化自Thermuscaldophilus的葡糖苷酶等被发现有合成人参皂苷CK的活性，但一方面活性较低、转化过程中有中间产物累积；另一方面这些酶的基因序列均无报道，无法实现重组表达。在酶法合成人参皂苷CK的研究当中，不仅转化效率有待提高，而且同时应尽量减少甚至消除中间产物的累积，以最大程度加大人参皂苷CK的产量，降低下游分离纯化工作的难度。

来自硫磺矿硫化叶菌的β-糖苷酶（LacS，β-Glycosidase）已被报道具有合成人参皂苷CK的能力，但转化效率有限，无法满足大规模生产的需求。利用该酶合成CK的优势在于：1、该酶已被重组表达，适于通过蛋白质工程手段进一步提高其催化效率；2、该酶的反应温度较高，热稳定性非常好，有助于在高温生产条件下完成产物合成，提高转化效率，降低生产过程中污染的可能；3、该酶催化合成人参皂苷CK的中间过程已被清楚阐释；4、该酶的晶体结构已被报道，为其进一步改造以及对酶突变体的分析提供了重要的参考信息。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种β-糖苷酶突变体及其编码基因。

本发明提供的蛋白，命名为lacS-mut，是如下1）的蛋白质：

1）由序列表中的序列4的氨基酸残基序列组成的蛋白质；

2）将序列表中的序列4氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有β-糖苷酶活性的由1）衍生的蛋白质。

上述序列表中的序列4由489个氨基酸组成，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

编码上述蛋白的基因也是本发明保护的范围。

上述基因是如下(1）或(2）或(3）的DNA分子：

(1）序列表中序列3所示的DNA分子；

(2）在严格条件下与（1）限定的DNA序列杂交且编码具有β-糖苷酶活性蛋白的DNA分子；

(3）与（1）限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码具有β-糖苷酶活性蛋白的DNA分子。

上述严格条件为在6×SSC，0.5% SDS的溶液中，在65℃下杂交,然后用2×SSC,0.1% SDS和1×SSC,0.1% SDS各洗膜一次。

上述序列3均由1470个核苷酸组成，所述序列3的编码区为自5’末端第1-1470位核苷酸。

含有上述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也是本发明保护的范围。

上述重组载体为将上述蛋白的编码基因插入表达载体中，得到表达上述蛋白的重组载体，具体为将序列表中的序列3所示的DNA分子插入载体pET28a的NheI和XhoI识别位点间得到的重组载体。

上述蛋白、上述基因或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在作为β-糖苷酶中的应用也是本发明保护的范围。

上述蛋白在生产人参皂苷CK中的应用也是本发明保护的范围。

本发明的另一个目的是提供一种生产人参皂苷CK的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：