[发明专利]一种抗小麦黄花叶病毒转基因小麦代谢物检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及气相色谱-质谱联用检测技术，具体地说，涉及一种基于气相色谱-质谱联用技术的抗小麦黄花叶病毒转基因小麦代谢物检测方法。

背景技术

随着生物技术的日趋成熟及基因工程的不断深入，转基因作物品种日益增多。转基因产品的安全性问题一直是全球关注的焦点，直接关系到人类的健康和生态环境安全。目前，代谢组学方法已经成为转基因产品安全性评价的重要工具之一。其中，气相色谱-质谱联用（GC-MS）技术由于其具有分辨率高、峰容量大、灵敏度高及分析时间短等优势而备受代谢组学研究者的青睐，该分析技术被专家称为最宝贵的分析手段，此外，这项技术的最大优势是有大量可检索的谱库。

小麦是世界上最重要的粮食作物之一，近些年通过遗传修饰手段培育的抗病虫、抗除草剂和雄性不育小麦方面进行了不少有益的探索。小麦黄花叶病，亦称“梭条花叶病”，是我国小麦生产中的一种重要病毒病害，主要发生在长江中下游及一些分支流域，在渭河流域以及东部沿海地区也有发生。该病毒病在稻麦轮作种植区的危害尤其严重，一般减产10%~30%,重者达70%~80%,并呈逐年加重和蔓延的趋势。小麦黄花叶病是由小麦黄花叶病毒（wheat yellow mosaic virus,WYMV）引起的，该病毒由禾谷多黏菌（Polumyxa graminis）的游动抱子携带传播，防治非常困难。同时因在多发生病害地区的主栽小麦品种对此病害表现敏感，而对小麦生产构成严重威胁。

于嘉林等（2002年)利用Act1启动子和除草剂选择标记bar基因，构建了含有小麦黄花叶病毒外壳蛋白基因的植物表达载体，并采用基因枪法导入小麦品系，获得了抗小麦黄花叶病毒转基因小麦。且外源基因可以在后代中遗传，转基因株系的后代对小麦黄花叶病毒呈现高度抗性。经Western blot和RT-PCR检测发现，抗病转基因小麦体内外壳蛋白基因在病毒感染后的表达水平出现明显下降。今后抗小麦黄花叶病毒转基因小麦的种植会迅速发展，具有极高的推广价值和应用前景。同时迫切需要有专门的机构对转基因作物进行长期、系统的跟踪检测、安全评价研究，因此建立抗小麦黄花叶病毒转基因小麦的GC-MS技术的提取方法具有重要的理论和现实意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种抗小麦黄花叶病毒转基因小麦代谢物检测方法，特别是一种基于气相色谱-质谱联用技术的抗小麦黄花叶病毒转基因小麦代谢物检测方法。

为了实现本发明目的，本发明的一种基于气相色谱-质谱联用技术的抗小麦黄花叶病毒转基因小麦代谢物检测方法。

本发明的目的是采用以下的技术方案来实现的。依据本发明提供的一种抗小麦黄花叶病毒转基因小麦代谢物检测方法，包括以下步骤：1）将抗小麦黄花叶病毒转基因小麦的种子脱壳，磨成粉状，加入提取溶液于4℃浸提；2）离心后干燥，加入内标物；3）干燥，加入衍生试剂；4）采用气相色谱-质谱联用的方法对衍生后的样品进行分析；

其中，步骤1）中所述提取溶液为体积比为2：3：3的水、乙腈和异丙醇的混合液。

优选地，步骤4）中色谱条件为：柱箱程序：60℃保持1min，然后每分钟10℃升温至325℃，保持10min，1min后运行；前进样器：10μl；进样量：1μl；载气：He，99.999%；压力：10.473psi；色谱柱：DB-5ms:1611.66442；DB-5ms325℃：30m×0.25mm×0.25μm；

步骤4）中质谱条件为：EI能量：70eV；离子源温度：230℃；四级杆温度：150℃；溶剂延迟：7min。

前述的检测方法，步骤1）中为向100mg粉末中加入1mL提取溶液于4℃浸提。浸提时间优选为20min。

前述的检测方法，步骤2）中所述离心优选在4℃，12200g/min，离心2min。

前述的检测方法，步骤2）中使用的内标物优选为十四酸。

前述的检测方法，步骤3）中所述衍生试剂的制备方法为：将10μl盐酸甲氧胺溶于40mg/ml吡啶中，30℃，1500g，振荡90min，然后加入N-甲基-N-三甲基硅烷三氟乙酰胺和1%三甲基氯硅烷（MSTFA+1%TMCS）90μl，37℃，振荡30min，即得。衍生时间优选为30min或90min。

本发明还提供一种用于抗小麦黄花叶病毒转基因小麦代谢物GC-MS检测的提取试剂，所述提取试剂为体积比为2：3：3的水、乙腈和异丙醇的混合液。