[发明专利]一种用4-硝基-1-萘酚或其衍生物为显色团制备β-半乳糖苷酶显色底物的方法及其应用

权利要求书

1.一种用4-硝基-1-萘酚或其衍生物为显色团制备β-半乳糖苷酶显色底物的方法及其应用；具体涉及将β-D-吡喃半乳糖羟基全部酰化成酯并进一步转变成α-溴代半乳糖酯，再用4-硝基-1-萘酚或其衍生物类显色团取代溴得到β-D-吡喃半乳糖苷酯，将这类糖苷酯脱去酰基得β-D-吡喃半乳糖苷作为β-半乳糖苷酶的显色底物；这类显色底物在β-半乳糖苷酶作用释放4-硝基-1-萘酚或其衍生物为显色产物，用于通过测定显色产物吸收确定β-半乳糖苷酶活性。

2.据权利要求1，一种用4-硝基-1-萘酚或其衍生物为显色团制备β-半乳糖苷酶显色底物的方法及其应用，所述β-D-吡喃半乳糖苷类显色底物结构如下：

R＝-GOOH，-COGH₃，-NO₂，-Cl

当R不为H时则为但不限于为-COOH，-COCH₃，-NO₂，-Cl或-Br；这些取代基位于萘环的5，6，8中任一或多个位置，即有多个取代基的4-硝基-1-萘酚衍生物也适合作为显色团用于制备此类显色底物；这些适合的显色团包括但不限于4，5-二硝基-1-萘酚、4，8-二硝基-1-萘酚、6-羧基4-硝基-1-萘酚、6-溴4-硝基-1-萘酚、6-乙酰基4-硝基-1-萘酚、6-氯-4-硝基-1-萘酚。

3.据权利要求1，一种用4-硝基-1-萘酚或其衍生物为显色团制备β-半乳糖苷酶显色底物的方法及其应用，β-半乳糖苷酶的这类显色底物合成过程涉及如下步骤：

(一)β-D-吡喃半乳糖在碱或酸催化下，用包括但不限于甲酸或乙酸短链羧酸对应的酰化剂在有或无溶剂条件下反应得β-D-吡喃半乳糖五羧酸酯为中间体1；所用碱催化剂包括但不限于碳酸和醋酸的无水钠盐和钾盐、吡啶和三乙胺；所用酸催化剂包括但不限于磷酸、硫酸、对甲苯磺酸；所用酰化剂包括但不限于甲酸酐、甲酰氯、乙酸酐及乙酰氯；所用溶剂包括但不限于丙酮或四氢呋喃或二者混合物；

(二)以甲酸或乙酸为溶剂吸收气体HBr制成对应溶液，再加入中间体1反应生成α-溴代-D-吡喃半乳糖苷四羧酸酯为中间体2；

(三)在无机碱和丙酮或二甲基甲酰胺或水及其混合物中，上述中间体2与4-硝基-1-萘酚或其衍生物以混悬液状态反应生成4-硝基-1-萘-β-D-吡喃半乳糖苷四羧酸酯为中间体3或4-硝基-1-萘酚衍生物的β-D-吡喃半乳糖苷四羧酸酯为中间体3；所用无机碱包括但不限于氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钾和碳酸钠碳；相转移催化剂也适用于此步反应制备所述中间体3，这类相转移催化剂包括但不限于四丁基溴化铵、四苄基溴化铵；

(四)中间体3在碱催化下，在甲醇或乙醇或水中脱酰基得4-硝基-1-萘基-β-D-吡喃半乳糖苷或4-硝基-1-萘酚衍生物的β-D-吡喃半乳糖苷，即为β-半乳糖苷酶的新型显色底物；所用碱催化剂包括但不限于甲醇钠、甲醇钾、氢氧化钠、氢氧化钾。

4.据权利要求1，一种用4-硝基-1-萘酚或其衍生物为显色团制备β-半乳糖苷酶显色底物的方法及其应用，这类显色底物制备方法还包括用权利要求3步骤(一)制备的中间体1，在三氟化硼-乙醚及三丁基氧化锡或三甲基硅基三氟甲磺酸银催化下，用苯为溶剂与4-硝基-1-萘酚或其衍生物反应得所述β-D-吡喃半乳糖苷类显色底物。