[发明专利]一种用4-硝基-1-萘酚或其衍生物为显色团制备β-半乳糖苷酶显色底物的方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及β-半乳糖苷酶新型显色底物合成方法及在测定β-半乳糖苷酶活性中的应用，包括但不限于检测β-D-半乳糖苷酶活性和基于检测β-半乳糖苷酶活性的免疫分析；此类新型显色底物用于中性或偏酸性连续跟踪β-半乳糖苷酶反应过程，在测定显色产物吸收灵敏度方面明显优于用4-硝基苯酚类显色团制备的显色底物。 

背景技术

光度法测定β-半乳糖苷酶活性主要有终点法和连续跟踪过程法；在自动化分析领域，连续跟踪酶反应过程测定酶活性有明显优势；适合连续跟踪β-半乳糖苷酶反应过程的显色底物包含对-硝基苯基-β-D-半乳糖苷[Biochemical Zeitschrift，1960，333：209]、4-甲基扇形酮基-β-D-半乳糖苷[J Organ Chem，1962，27：1074]、氯酚红基-β-D-半乳糖苷等。这些显色底物在pH＜7时对应显色产物消光系数都很低，都不适合在pH＜7的缓冲液中连续跟踪β-半乳糖苷酶反应过程；而4-硝基-1-萘酚在pH5.5以上消光系数都很高(图1)，显著高于4-硝基苯酚(pNP)和邻硝基苯酚(oNP)，用于合成这类显色底物在测定显色产物灵敏度上更有优势。 

发明内容

本发明用4-硝基-1-萘酚类显色团制备β-半乳糖苷酶的新型显色底物；这些显色底物被酶水解释放的显色产物吸收峰在460nm附近，且在pH5.5到pH7.0之间的摩尔消光系数比4-硝基苯酚高1倍以上，在偏酸性的条件下连续跟踪β-半乳糖苷酶的反应过程具有明确优势，便于高灵敏度自动化分析；在pH＞7.0以上缓冲液中，此类新型显色底物所得显色产物的摩尔消光系数也显著高于4-硝基苯酚。 

4-硝基苯基-β-D-半乳糖苷也有合成方法报道，如文献[Tetrehedron Letter，2007，48(6)：993-996]、[Journal of Agricultural and Food Chemistry，2007，55(4)：1405-1410]、[CarbonhydrateResearch，2009，344(4)：511-515]、[Carbonhydrate Research，2009，344(16)：2245-2249]所述；主要有三种方法合成β-D-半乳糖苷： 

方法1：β-D-吡喃半乳糖在碱催化或酸催化下与短链酰化剂在有或无溶剂条件下反应制得β-D-吡喃半乳糖五羧酸酯为中间体1；中间体1与HBr乙酸溶液反应生成α-溴代-D-吡喃半乳糖四乙酸酯为中间体2；中间体2与酚类显色团在碳酸钾的丙酮溶混悬液中反应生成酚类对应的β-D-吡喃半乳糖苷四羧酸酯为中间体3；此中间体3在碱催化下甲醇溶液中脱乙酰基得目标显色底物β-D-吡喃半乳糖苷；所用酰化剂主要是乙酰氯或乙酸酐、甲酰氯或甲酸酐。 

方法2：上述中间体2与4-硝基-1-萘酚或其衍生物在相转移催化剂如四丁基溴化胺(TBAB)和无机碱包括但不限于氢氧化钠作用下反应制得新型β-D-半乳糖苷类显色底物。 

方法3：中间体1在三氟化硼-乙醚及三丁基氧化锡催化下，在苯中与4-硝基-1-萘酚直接反应得到β-半乳糖苷酶的新型β-D-半乳糖苷类显色底物。 

4-硝基-1-萘酚或其衍生物为显色团的β-半乳糖苷酶显色底物至今未见报道；理论上可用类似于4-硝基苯酚反应制备，故有上述方法1、方法2和方法3应都适用。 

本发明所述β-半乳糖苷酶的新型显色底物合成方法及应用包括如下内容： 

a本发明所涉及4-硝基-1-萘酚或其衍生物为显色团的β-半乳糖苷酶显色底物为β-D-吡喃半乳糖苷，具有如下的结构通式： 

R＝-COOH，-GOCH₃，-NO₂，-CI 

其中，R基团为-H，-COOH，-COCH₃，-NO₂，-Cl或-Br，处于5，6，8中任一或多个位置；这些衍生物包括4-硝基-1-萘酚的单取代或多取代衍生物。 

b制备β-半乳糖苷酶的上述新型显色底物，包括如下合成步骤(图2)： 

b1β-D-吡喃半乳糖在碱或酸催化下与来自短链羧酸包括但不限于甲酸和乙酸的酰化剂在有或无溶剂条件下反应制得β-D-吡喃半乳糖五羧酸酯为中间体1；此步骤中所用碱类催化剂包括但不限于碳酸和醋酸的无水钠盐和钾盐、吡啶和三乙胺；所用酸催化剂包括但不限于磷酸、硫酸、对甲苯磺酸；所用酰化剂包括但不限于甲酸酐或甲酰氯、乙酸酐或乙酰氯、丙酸酐或丙酰氯；所用溶剂包括但不限于丙酮或四氢呋喃或二者的混合物；