[发明专利]一种具有抗肿瘤活性的低抗凝肝素的制备方法

权利要求书

1.一种制备具有抗肿瘤活性的低抗凝肝素的方法，是以现有肝素为起始物进行完全脱硫酸化肝素的制备，进而进行N-位重新硫酸化，在此基础上采用3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸(PAPS)再生系统，通过AST-1V、6-OST-1和2-OST组合酶法合成特定位点硫酸化肝素，最后再将以上肝素衍生物进行N-位脱硫酸化，最终得到具有低抗凝活性的专一抗肿瘤作用的肝素衍生物。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：肝素钠过氢离子交换柱得到肝素酸溶液，用三丁胺(tributylamine，TBA)将该溶液pH调至5.5左右，冻干得到肝素三丁胺盐，将冻干粉溶于含10％甲醇的二甲亚砜溶液中，105℃，反应12-36h，优选为24h；醇沉，透析，脱盐，冻干得到完全脱硫酸化肝素按质量比1∶2逐步加入三甲基铵三氧化硫共聚物(trimethylamine sulfur trioxide complex，TMA·SO3)，30-70℃，pH 9条件下反应2-10h，优选为55℃，pH 9条件下反应6h。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在完全脱硫酸化肝素的基础上，通过肝素生物合成酶6-OST-1和2-OST将PAPS再生系统中PAPS分子的活性硫酸基转移到低抗凝血活性肝素的特定序列位置，生成低抗凝血活性而较好抗肿瘤活性的肝素衍生物；所述PAPS再生系统是通过AST-IV(Arylsulfotransferase IV)的酶促反应，由对硝基苯酚磺酸钾盐(PNPS)和3’-磷酸腺苷-5’-磷酸(PAP)制备PAPS，PNPS的浓度为0.1-10mM，PAP的浓度为0.1-50μM，AST-IV的用量为0.1-50mg/ml，优选为5-10mg/ml。

4.根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于：酶法硫酸化反应条件为室温下震荡(300rpm)反应1-15h，优选为4-8h，反应液包含50mM Tris-HCl(pH 7.2)，1％Triton X-100，1％BSA，1mM MgCl₂，1mM MnCl₂，1mM PNPS，40μM PAP，4mg AST-IV，肝素生物合成酶6-OST-1或2-OST的用量为0.1-50mg/mg底物，优选为1-20mg/mg底物。

5.根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于：所述方法中，按照以下方法纯化酶促反应产物：终止反应后，离心分离得到上清液，将此上清液与两倍体积的缓冲液A混合，对DEAE柱上样；依次以缓冲液A和缓冲液B进行梯度洗脱，收集第二次洗脱所得洗脱液，得到酶促反应产物；所述DEAE柱分离所用的缓冲液A为含质量百分含量为0.5-2.5％的NaCl水溶液，缓冲液B为含质量百分含量为2.5-5.0％的NaCl水溶液。