[发明专利]一种具有抗肿瘤活性的低抗凝肝素的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种具有抗肿瘤活性的低抗凝肝素的制备方法。

背景技术

自1935年以来肝素作为抗凝药物已广泛应用于临床，但其除了抗凝血的作用以外，还具有促进脂蛋白脂酶和肝脂酶的释放，抑制补体激活，抑制血管生成和肿瘤生长，抗病毒等活性。近来发现肝素在抗炎以及抗肿瘤转移方面也发挥着重要作用。然而，由于肝素强烈的抗凝活性，限制了它的临床应用，对肝素进行化学或酶法修饰，可降低其抗凝活性，但可增强其抗肿瘤作用。

肝素的抗凝血活性来自于它的一个特殊的戊糖结构顺序，这个戊糖结构与抗凝血酶(AT-III)的结合可以导致其构象改变而被活化。对肝素这个特殊五糖结构的微小改变都会导致与抗凝血酶结合力的下降，从而显著降低其抗凝血活性。现有研究表明，肝素与AT-III结合发挥抗凝血活性取决于其戊糖活性中心的数量。戊糖结构中N-位，3-O-位及6-O-位硫酸基参与结合AT-III，与抗凝血活性有关；而2-O-位硫酸基和艾杜醛酸的作用尚不清楚，其中3-O-位硫酸基尤其重要，如果缺少3-O-位硫酸基，肝素的抗凝血活性则会降低1000倍以上。另有研究发现，N-位脱硫酸化肝素的抗凝、抗FIIa、抗FXa活性分别是未修饰肝素的1.5％、0.9％、0.1％，说明N-位硫酸基是肝素抗凝活性所必需具有的。

几乎所有的研究都证实，肝素的抗肿瘤活性在很大程度上并不依赖于其抗凝血活性，主要取决于它的硫酸基取代情况(sulfation pattern，硫酸化图案)。据文献报道，肝素结构中葡萄糖胺6-O-位硫酸基的存在对于肝素的抗肿瘤和抗炎活性至关重要。Lapierre等证实肝素结构中葡萄糖胺6-O-位硫酸基和N-位硫酸基对其抗肿瘤转移活性是必需的。并有研究发现6-O-位和N-位脱硫酸化肝素可降低肝素的抗病毒活性，而2-O-位和3-O-位脱硫酸化肝素则基本无影响。陈金联等研究N-位脱硫酸肝素对人胃癌重度联合免疫缺陷SCID小鼠转移模型肿瘤转移抑制、血管生成和表达的影响。陈明祥等发现N-位脱硫酸肝素通过抑制胃癌组织bFGF基因表达和血管生成，抑制肿瘤转移，而N-位脱硫酸肝素无明显出血等不良反应。

国内外药物研究人员尝试用化学法对肝素的结构改造，化学法脱硫酸化可以在一定的程度上降低肝素的抗凝血活性，但由于缺乏选择性及硫酸化程度过低，导致抗肿瘤活性不明显。因此，选择性地去掉一些与抗凝相关的硫酸基，如3-O-位硫酸基；用酶法特异性的修饰与抗肿瘤活性有关的位点，如6-O-位硫酸基，、2-O-位硫酸基，就有可能合成具有低抗凝活性的专一抗肿瘤作用的肝素衍生物。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有抗肿瘤活性的低抗凝肝素的制备方法。

本发明的技术方案为：以肝素为起始物，首先用化学法进行完全脱硫酸化肝素的制备，然后在pH 9.0的条件下用硫酸化试剂进行N-位重新硫酸化，在此基础上采用PAPS再生系统，以6-OST-1酶和2-OST酶对特定位点进行有效的选择性硫酸化，合成得到具有低抗凝活性的专一抗肿瘤作用的肝素衍生物。

本发明提出的具有抗肿瘤活性的低抗凝肝素的具体操作步骤如下：采用不同的硫酸基转移酶组合来实现合成。首先从N-位硫酸化肝素出发，通过AST-IV和6-OST-1合成N-位，6-O-位硫酸化的衍生物；通过AST-IV和2-OST合成葡萄糖醛酸2-O-位硫酸化的衍生物，并进一步通过AST-IV和6-OST-1合成N-乙酰氨基葡萄糖6位硫酸化的衍生物，即得N-位，6-O-，2-O-位硫酸化肝素。最后再将以上肝素衍生物在含10％甲醇的二甲亚砜溶液中反应2h，进行N-位脱硫酸化，最终得到6-O-位硫酸化肝素、2-O-位硫酸化肝素和6-O-，2-O-位硫酸化肝素。

本发明的独到之处有两点：首先将对现有肝素药物进行完全脱硫酸化，最大限度地降低抗凝血活性中心的数量，从而大幅度降低其肝素的抗凝血活性。其次用6-OST-1酶和2-OST酶选择性修饰与抗肿瘤活性有关的硫酸基，提高其活性位点的电荷密度。这种肝素衍生物避免了普通肝素运用于肿瘤患者出现出血、血小板减少、骨质疏松等副作用。本发明将有助于拓宽肝素类药物的临床应用范围，因此其不仅具有科学研究价值，而且将具有较大的社会价值和经济价值。

具体实施方式

以下利用实施例进一步详细说明本发明，但不能认为是限定发明的范围。

实施例一：完全脱硫酸化肝素的制备