[发明专利]一种GA4和/或GA7的分离纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种GA₄和/或GA₇的分离纯化方法，具体涉及萃取、反萃取、减压浓缩、结晶分离，属于生物分离领域。

背景技术

赤霉素（Gibbeerllins，简称GAs）是一种天然的植物生长调节剂，对植物生长具有多种生理功能，可以调节植物生根、发芽、生长以及开花结果等过程，因此在农作物生产及蔬菜种植中有着广泛应用。现已发现的赤霉素达百余种,但它还不能完全由化学法合成，目前工业化生产的赤霉素均是由微生物发酵获得。GA₃是菌种发酵积累的主要产物，也是所有赤霉素中生理活性最强,应用最广泛的。至今GA₃的发酵、分离检测技术已经发展得相当成熟。随着研究的深入，逐步发现GA₃应用上的局限性。例如:GA₃在使胚轴生长的过程中会降低植物的抗倒伏性，在提高果树座果率的同时会引起过度生长，影响果实的形状等。新型赤霉素产品的开发成为当前研究的热点，GA₄₊₇以其较高的活性和独特的优势成为目前最有潜力的品种。GA₄₊₇的研究还处于起步阶段，GA₄₊₇的生产能力仍处于较低水平，其价格是GA₃的几十倍。对菌种进行诱变或利用基因工程手段进行改良后的菌种生产效价有所提高，但仍不能得到单一的GA₄₊₇，发酵液中存在各种赤霉素混合物，给后期的分离纯化带来了困难。GA₄与GA₇均是19碳赤霉素，其化学结构上仅有一个双键之差，化学性质非常相近，所以一般的检测方法也很难将其区分开。当前建立一种有效的GA₄和/或GA₇的分离纯化和检测方法将具有很好的应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种GA₄和/或GA₇分离纯化方法，该分离方法能得到纯度较高的GA₄和/或GA₇，经由HPLC定量测试后发现其纯度高于96%。

本发明的技术方案为：一种GA₄和/或GA₇的分离纯化方法，其具体步骤如下：

（1）将含GA₄和/或GA₇的溶液用酸调pH4.0～7.0，加入有机溶剂振荡萃取，得萃取液;将萃取液转移到分液漏斗，静置待分层后,分别得到有机相A与溶液;

（2）将步骤（1）中分层得到的溶液用酸调pH2.0～3.0,再加入有机溶剂振荡萃取,得萃取液;将萃取液转移到分液漏斗，静置待分层后,得有机相B;

（3）将步骤（1）和(2)所得的有机相A与有机相B混合，得有机相混合液，加入用酸调pH4.0～6.0的蒸馏水振荡萃取,得萃取液;将萃取液转移到分液漏斗,静置待分层后,得有机相C;

（4）向有机相C中加入吸附剂吸附，过滤后得滤液;

（5）将步骤（4）得到的滤液减压浓缩，待液体全部旋干后，收集固体物质;

（6）将收集的固体物质溶解到有机混合物中，低温下重结晶;过滤收集晶体。

优选步骤（1）中所述的含GA₄和/或GA₇溶液为含有GA₄和/或GA₇的赤霉菌发酵液或者是含有GA₄和/或GA₇的赤霉素混合物溶液；其中赤霉菌发酵液或者是赤霉素混合物溶液中GA₄和/或GA₇的质量百分含量为5%～90%；步骤（1）和（2）中加入的有机溶剂均为C1-C10的醇、C1-C10的酯或C1-C10的酮；步骤（1）和（2）中萃取时有机溶剂与步骤（1）中的含GA₄和/或GA₇溶液的体积比均为1：(3～5)；步骤（3）中有机相混合液与蒸馏水体积比为1:(3～5)。更优选步骤（1）和（2）中加入的有机溶剂均为乙酸乙酯、乙酸丁酯、甲基乙基酮、戊酮、正丁醇或正戊醇。

优选步骤（1）、（2）和（3）中调pH的酸均为HCl或H₂SO₄；步骤（1）、（2）和（3）中振荡萃取的条件均为:摇床转速120～160rpm,萃取时间0.5～1.5小时。