[发明专利]临床样本前处理方法以及临床样本中诺如病毒的检测方法和试剂盒

权利要求书

1.一种非疾病的诊断和治疗目的的临床样本中诺如病毒的检测方法，包括临床样本的前处理，利用检测诺如病毒的扩增引物对前处理后的临床样本进行RT-PCR扩增，检测是否有特异性扩增产物以判断临床样本中是否含有诺如病毒，其特征在于，所述的临床样本的前处理是用固相聚苯乙烯对临床样品中的诺如病毒进行吸附，然后洗涤去除非吸附物，再解吸附收集吸附物，即为前处理后的临床样本。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的固相聚苯乙烯为高亲和力酶标板。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的临床样本的前处理具体为：

（a）临床样本处理：用DEPC处理的PBS溶液稀释采集的待检测临床样本至10%（w/v）浓度，充分振荡混匀，并于12000g下离心10min，收集上清用于诺如病毒捕获；

（b）取上清加入高亲和力酶标板上，37℃放置1.5h，然后弃去板中的溶液，用DEPC处理的PBS溶液洗涤三次，加入无RNase的水，置于95℃加热5min，并立即冰浴，得到前处理后的临床样本。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的利用检测诺如病毒的扩增引物对前处理后的临床样本进行RT-PCR扩增为采用20μL的一步法RT-PCR反应体系，反应体系含有2×one-step RT-PCR MIX 10μL，10μmol/L的检测诺如病毒上游引物和下游引物各1μL，MLV/RNasin/HS-Taq混合酶0.8μL，RNA模板7.2μL，反应条件为：50℃反转录30min，94℃预变性3min，然后94℃30s，50℃30s，72℃30s，共35次循环后，72℃最后延伸7min。

5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述的检测诺如病毒上游引物和下游引物为以诺如病毒的N/S区为靶序列设计检测诺如病毒GⅡ型通用引物，其为：

上游引物：5’-CNTGGGAGGGCGATCGCAA-3’；

下游引物：5’-CCRCCNGCATRHCCRTTRTACAT-3’。

6.一种临床样本中诺如病毒的检测试剂盒，其特征在于，包括高亲和力酶标板，检测诺如病毒上、下游引物，RT-PCR反应试剂，DEPC处理的水，DEPC处理的PBS溶液。

7.根据权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于，所述的检测诺如病毒上游引物和下游引物为以诺如病毒的N/S区为靶序列设计检测诺如病毒GⅡ型通用引物，其为：

上游引物：5’-CNTGGGAGGGCGATCGCAA-3’；

下游引物：5’-CCRCCNGCATRHCCRTTRTACAT-3’。

8.根据权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于，所述的RT-PCR反应试剂包括2×one-stepRT-PCR MIX和MLV/RNasin/HS-Taq混合酶。

9.一种临床样本前处理方法，其特征在于，所述的临床样本前处理是用固相聚苯乙烯对临床样本中的诺如病毒进行吸附，然后洗涤去除非吸附物，再解吸附收集吸附物，即为前处理后的临床样本。

10.根据权利要求9所述的临床样本前处理方法，其特征在于，所述的临床样本的前处理具体为：

（a）临床样本处理：用DEPC处理的PBS溶液稀释采集的待检测临床样本至10%（w/v）浓度，充分振荡混匀，并于12000g下离心10min，收集上清用于诺如病毒捕获；

（b）取上清加入高亲和力酶标板上，37℃放置1.5h，然后弃去板中的溶液，用DEPC处理的PBS溶液洗涤三次，加入无RNase的水，置于95℃加热5min，并立即冰浴，得到前处理后的临床样本。