[发明专利]临床样本前处理方法以及临床样本中诺如病毒的检测方法和试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于微生物检测领域，具体涉及一种临床样本前处理方法以及临床样本中诺如病毒的检测方法和试剂盒。

背景技术：

诺如病毒（Norovirus，NoV）是全球流行性腹泻的首要病原，也是散发性腹泻的主要病原之一，每年大约发生2.67亿起相关感染事件，并且80~95%的流行腹泻疫情与NoV有关，造成巨大经济损失，世界卫生健康组织（WHO）已将其定义为B类病原。NoV于1968年首次被报道，造成当地一所学校50%的学生及32%的接触者感染。上世纪90年代US95/96变异株的出现标志着GⅡ.4型成为流行株主要基因型，此后每隔两三年就会出现新的GⅡ.4变异株。近二十年来已经暴发了至少四次大范围的病毒流行，包括1995~1996，2002~2003，2004~2005，2006~2007。由于缺乏合适的体外培养和复制体系，人类的病毒感染背景比较复杂，以及宿主敏感性呈现多样化等因素，加大了NoV研究难度。

NoV主要以粪口方式进行传播，病人的腹泻或呕吐样本一般含有大量的病毒粒子。除此之外，受污染的水源和食物，如牡蛎、冰、鸡蛋、色拉等，尤其是生吃或食用加工不当的贝类是导致NoV胃肠炎暴发流行的最常见原因。NoV的高危性由两个因素造成，一是低感染剂量，10~100个病毒颗粒就能引起感染；二是高稳定性，病毒对加热、低温、酸碱和去污剂等都具有较强的抵抗性。室温、pH2.7的环境下3h或20%的乙醚4℃处理18h后仍有感染性；可耐受普通饮用水中3.75~6.25mg/L的氯离子浓度（游离氯0.5~1.0mg/L），在10mg/L高浓度氯离子（处理污水采用浓度）条件下才被灭活。NoV对高温、冰冻、高压等也有一定的耐受度，60℃孵育30min后，病毒不能完全灭活；冰冻3个月对食品中NoV活性没有任何影响；商业上通用的烹饪高压对贝类中病毒的灭活作用有限。

NoV感染引起的胃肠炎为自限性疾病，患者一般会在72h内自愈，但病毒传播能力强，感染剂量低，在环境中能长期稳定存在，易在学校、医院、疗养院、军队、轮船等封闭的环境中短时间内就造成大范围感染，并且对老人、儿童及免疫力低下人群还易造成其他并发症甚至脱水性死亡。NoV被称为“胃肠炎流感病毒（Gastric Flu）”，其进化模式类似于流感病毒，具有明显的季节性，目前还缺少有效的预防和治疗手段，对抗病毒研究以及监测网络的建立提出了严峻的挑战。

NoV基因组大约7.5~7.7kb，包括3个开放阅读框，分别编码非结构蛋白前体、衣壳蛋白VP1和次衣壳蛋白VP2。衣壳蛋白包裹病毒，易受到外界的影响而发生变异，对于逃逸宿主免疫、增强病毒粒子稳定性及适应外界变化等具有重要意义，常用作病毒分型的标准。根据其衣壳蛋白序列同源性可分成5个基因组（Genogroup），基因组之间的核酸序列同源性约46%，其中G Ⅰ、GⅡ和GⅣ为人源病毒。同一基因组内的核酸同源性为69%~97%，进一步分成不同的基因型（Genotype），例如G Ⅰ含有8个基因型，GⅡ含有19个（并不断增加）。病毒的基因多样性增加了研究的困难，因此加强国际之间的合作，建立标准的病毒分型和命名规则，将有助于诺如病毒的深入研究。目前美国和欧洲都已建立了相应的病毒数据库（CaliciNet:www.cdc.gov/foodsafety/activities.html#calicinet;NoroNet:www.noronet.nl/noronet/），为流行株变化分析和病毒进化研究提供了数据信息。而我国相应的监测与积累工作还不太成熟，有必要加强临床样本的收集，同时，更要重视环境与食品中的NoV污染状况的监测，这对于病毒的传播特点、分布规律以及稳定性等研究具有指导意义。

随着检测技术的发展，越来越多未知因素的胃肠炎被证明是由诺如病毒引起的。目前NoV检测技术主要包括电镜观察、免疫技术及RT-PCR检测技术等，然而电镜观察到的病毒颗粒仍然很少，使得该方法的灵敏度比较低，，需要腹泻样本中病毒粒子的浓度至少为10⁶个/mL，并且还需要贵重的仪器以及有经验的操作人员，从而限制了该技术的应用。免疫学检测方法具有操作简单、检测快速、不需要昂贵仪器等诸多优点，但由于病毒的抗原变异性强，多株病毒可能同时流行的特点可能是免疫学方法检出率低的原因，并且用于检测的抗原，可能与带检样本中病毒的抗原相差比较大，以至于没有足够的交叉反应，降低了方法的灵敏度。RT-PCR检测方法经过几十年的发展，已经被认为是诺如病毒检测的“金标准”，该方法已经可以达到快速、简单、灵敏度高的检测要求，并且通过序列分析，为病毒溯源等工作提供了数据支持。