[发明专利]从哺乳动物血液中提取超氧化物歧化酶的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种食品加工的技术领域，尤其是涉及一种从哺乳动物血液中提取超氧化物歧化酶的方法。

背景技术

现有经典McCord-Fridovich法：第一步除去血红蛋白。采用Tsuchihashi方法，即在溶血液中加入0.25倍体积乙醇及0.15倍体积的氯仿，在4℃下不断搅拌15分钟，使血红蛋白变性、沉淀，然后加入0.1倍体积的水，搅拌均匀。在4℃离心分离出乙醇-氯仿相。

第二步有机溶剂沉淀。将乙醇-氯仿提取液置于室温下平衡，每1000毫升中加入300克无水磷酸氢二钾的水溶液和氯仿，而上相液含有磷酸氢二钾较少，主要是乙醇。超氧化物歧化酶存在于上相液。去掉下相液，收集上相液。在4℃条件下加入预冷至-20℃的0.75倍体积的丙酮使超氧化物歧化酶沉淀，在4℃下高速离心后，即可得粗酶制品。

第三步将丙酮沉淀物悬于少量水中，用2.5毫摩尔/升的pH7.8磷酸钾缓冲液在4℃下透析12-24小时，换液4-6次。透析后离心分出上清液，将上清液加到预先用2.5毫摩尔/升磷酸钾缓冲液平衡过的DEAE-纤维素柱中，然后用pH7.8的2.5-200毫摩尔/升的pH7.8磷酸钾缓冲液梯度洗脱。

McCord-Fridovich法中使用乙醇和氯仿，有些学者怀疑用乙醇-氯仿沉淀血红蛋白可使超氧化物歧化酶的蛋白质性质发生变化，如Harts与Deutch认为Tsuchihashi方法会损伤超氧化物歧化酶，遂采用其他方法除去血红蛋白，但比较麻烦，而且酶产量较低，Bannister等指出，采用乙醇氯仿处理与不处理所得的超氧化物歧化酶并无性质上差别。

发明内容

本发明克服现有技术中的不足，提供了一种低成本、高效益、高纯度、工业规模化生产的从哺乳动物血液中提取超氧化物歧化酶的方法。

为了解决上述技术的问题，从哺乳动物血液中提取超氧化物歧化酶的方法本发明是通过以下技术方案实现的：它包括以下步骤：(a)哺乳动物血液的采集；(b)溶血；(c)铜盐存在下的热变性；(d)超滤浓缩(e)丙酮沉淀并采用旋转蒸发仪回收丙酮；(f)柱层析；(g)冷冻干燥。

本发明也可以通过以下技术方案实现：以上所述的哺乳动物血液的采集为：在肉联厂屠宰轨道的放血位置上放置接血槽，在接血过程中同时加入抗凝剂并不断搅拌，抗凝剂为接血重量比的1/8～1/6，抗凝剂为3.8％的食品级柠檬酸钠。

本发明也可以通过以下技术方案实现：以上所述的溶血为：将所得血细胞加入3～4倍量的去离子水，搅拌溶血至少30分钟，备用。

本发明也可以通过以下技术方案实现：以上所述的铜盐存在下的热变性：(1)、将收集的每100升红细胞中添加100升的蒸馏水、3.8～4升的氯化钠和38～40毫升的氯化铜搅匀，水浴加热到68～70℃恒温20～30分钟，将反应液泵入冷却罐，用搅拌机搅拌，迅速冷却至室温，至少再搅拌2小时，铜离子与蛋白质结合成变性血红蛋白而沉淀，用甩干机甩干过滤去变性血红蛋白沉淀，得滤液1；(2)、将滤液1在68～70℃恒温水浴下，向滤液1中慢慢加入38～40毫升的氯化铜，至滤液清澈变为淡蓝色为止，保温至少20分钟，将反应液泵入冷却罐，用搅拌机搅拌，迅速冷却至室温，搅拌至少2小时，用甩干机甩干过滤去除铜离子与蛋白质结合成的变性血红蛋白，得滤液2。

本发明也可以通过以下技术方案实现：以上所述的超滤浓缩为：将滤液2经布氏漏斗抽滤去除细微颗粒，经中空纤维超滤器超滤浓缩至总体积的体积比1/20～1/25，收集浓缩液，中空纤维超滤器的截留分子量选为10千道尔顿。

本发明也可以通过以下技术方案实现：以上所述的丙酮沉淀并采用旋转蒸发仪回收丙酮：在浓缩液中，不断搅拌下缓慢加入预冷后的0.73～0.75倍全体积的工业丙酮，3～4℃放置至少1小时，产生大量絮状沉淀，采用碟式分离机以3000～3500转/分冷冻离心约30分钟，沉淀留用；将上清液回收再次不断搅拌下缓慢加入预冷后体积比的0.73～0.75全体积的工业丙酮，3～4℃放置至少1小时，3000～3500转/分冷冻离心20～30分钟。将两次沉淀合并，加入体积比2～3％的去离子水，充分搅匀，装入透析袋透析至少12小时，采用碟式分离机以3000～3500转/分冷冻离心大约30分钟，离心除去不溶性蛋白，并采用旋转蒸发仪回收丙酮，得透析液。