[发明专利]表达KCNQ1/KCNE1蛋白的宿主细胞及其制法

权利要求书

1.一种应用于BacMam重组杆状病毒载体构建中的引物，其特征在于：所述引物为如SEQID NO.3-4所示的KCNQ1引物或如SEQ ID NO.5-6所示的KCNE1引物。

2.一种BacMam重组杆状病毒载体，其特征在于，包含有：KCNQ1或KCNE1基因片段；其中，该KCNQ1或KCNE1基因片段通过以下方式获得：

以如SEQ ID NO.3-4所示的KCNQ1引物或如SEQ ID NO.5-6所示的KCNE1引物，分别从质粒pCDNA3.3-KCNQ1和质粒pCDNA3.3-KCND1上经PCR扩增获得KCNQ1或KCNE1基因片段。

3.如权利要求2所述的BacMam重组杆状病毒载体，其特征在于：所述质粒pCDNA3.3-KCNQ1是含有KCNQ1基因的pCDNA3.3质粒；

所述质粒pCDNA3.3-KCND1是含有KCND1基因的pCDNA3.3质粒。

4.一种如权利要求2所述的BacMam重组杆状病毒载体的构建方法，其特征在于，包括步骤：

（1）根据KCNQ1与KCNE1全基因序列设计特异性引物；

其中，KCNQ1的上游引物序列如SEQ ID NO.3所示；

KCNQ1的下游引物序列如SEQ ID NO.4所示；

KCNE1的上游引物序列如SEQ ID NO.5所示；

KCNE1的下游引物如SEQ ID NO.6所示；

（2）用KCNQ1与KCNE1的引物分别从质粒pCDNA3.3-KCNQ1和pCDNA3.3-KCND1上PCR扩增获得KCNQ1和KCNE1基因片段，并将这2个基因片段分别克隆到pFastBac1-pCDNA3.1(-)载体上，形成pFastBac1-pcDNA3.1(-)-KCNQ1和pFastBac1-pcDNA3.1(-)-KCNE1载体；

（3）将pFastBac1-pcDNA3.1(-)-KCNQ1和pFastBac1-pcDNA3.1(-)-KCNE1载体分别转化到Top10感受态细胞中，筛选出含KCNQ1或KCNE1的阳性克隆载体；

（4）将含KCNQ1或KCNE1的阳性克隆载体，分别转化到大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，经筛选，获得KCNQ1-BacMid或KCNE1-BacMid重组杆状病毒载体。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述步骤（3）的筛选中，是将转化后的Top10感受态细胞在含有50～200μg/mL氨苄青霉素的LB培养基平板上，36～38℃培养12～20小时后，挑单克隆，以通用引物CMV和BGH为引物，进行菌落PCR鉴定。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述步骤（4）的筛选中，是将转化后的大肠杆菌DH10Bac感受态细胞涂在含有50μg/mL卡那霉素、10μg/mL庆大霉素、100μg/mL四环素、100μg/mL 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖苷和40μg/mL异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷的LB培养基平板上，37℃培养30～72小时后，挑单克隆，以通用引物M13F和M13R作为引物，进行菌落PCR鉴定。

7.一种BacMam重组杆状病毒，其特征在于：所述BacMam重组杆状病毒是将如权利要求4所述的KCNQ1-BacMid和KCNE1-BacMid重组杆状病毒载体，分别转染进入昆虫SF9细胞后，获得KCNQ1-BacMam重组杆状病毒或KCNE1-BacMam重组杆状病毒。

8.如权利要求7所述的BacMam重组杆状病毒的构建方法，其特征在于，包括步骤：

1）将KCNQ1-BacMid或KCNE1-BacMid重组杆状病毒载体分别转染进入昆虫SF9细胞，分别获得P1代KCNQ1-BacMam重组杆状病毒或KCNE1-BacMam重组杆状病毒；

2）用P1代KCNQ1-BacMam重组杆状病毒和KCNE1-BacMam重组杆状病毒，继续感染昆虫SF9细胞，分别制备成病毒滴度在1～5×10⁸范围内的高滴度KCNQ1-BacMam重组杆状病毒和KCNE1-BacMam重组杆状病毒。