[发明专利]表达KCNQ1/KCNE1蛋白的宿主细胞及其制法

说明书

技术领域

本发明涉及一种表达通道蛋白的宿主细胞及其制法，特别是涉及一种利用BacMam病毒进行表达KCNQ1/KCNE1通道蛋白的宿主细胞及其制备方法。

背景技术

KCNQ钾通道是钾通道超家族的一个重要分支，KCNQ基因编码的钾离子通道，分布于神经节、脑皮质、海马神经细胞、心肌细胞、内耳毛细胞等，在调节神经兴奋性、心肌动作电位和听觉方面发挥作用。KCNQ分为5个亚型，即KCNQ1、KCNQ2、KCNQ3、KCNQ4、KCNQ5，其中，KCNQ1作为钾通道家族的一个成员，在心脏、内耳和小肠的生理调节和病理机制作用中均具有重要意义。

KCNQ1（即KvLQT1）最早发现于遗传性LQT综合征患者的一染色体位点，该基因位点编码钾离子通道，且与50%的遗传性LQT综合征相关。KCNQ1在两种组织中具有重要作用：在心肌细胞中，KCNQ1与KCNE1β-亚基结合形成通道复合物，参与形成的心肌I ks电流（缓慢整流），在动作电位复极化中具有重要作用，KCNQ1突变会引起心肌复极化延长而引起心律失常；在多种器官的上皮细胞中，如肺、胃、耳蜗、肠和肾，盐和水的运输对于功能的发挥起到至关重要的作用，研究发现KCNQ1通道表达的缺失对功能的发挥具有重要影响。人体内KCNQ1突变可能导致耳聋。此外，对KCNQ1基因敲除的小鼠的研究也显示，小鼠出现耳聋、平衡问题以及内耳和胃肠道形态异常的症状。KCNQ1与KCNQ家族其他几个亚型不同，KCNQ1一般不存在于神经组织中。

KCNQ亚家族成员的电流都已经于爪蟾卵等异源表达系统所表达。5种亚型均诱发电压依赖性外向整流钾电流。在哺乳动物细胞中，KCNQ1、KCNQ2、KCNQ3、KCNQ4的同源多聚体和KCNQ2/3的异源多聚体一样，都能在hek293和CHO细胞上产生M电流。KCNQ1同源多聚体通道可诱发外向整流，其半数激活电压（V1/2）为-10～20mV，斜率为12mV，其激活动力学曲线为S型，在100～200ms内可激发90%，当表达于爪蟾卵时，电流在2～3s内也不能达到最大，但是在哺乳动物细胞表达时，电流激活速度增加1s内可全部激活，且该电流的失活不明显。KCNQ1还可以与KCNE家族(钾通道超家族的另一成员)，特别是KCNE1相互作用，增强通道功能。当KCNE1存在时，KCNQ1的电流可大幅度增加，且激活减慢，失去失活特性。

杆状病毒是专一性感染昆虫细胞的病毒，具囊膜，其基因组为共价闭合环状双链DNA，分子量为130kb。自从Smith等用昆虫杆状病毒在昆虫细胞成功表达β-干扰素之后，昆虫杆状病毒受到广泛关注，至今，杆状病毒载体-昆虫表达系统已发展成一个较为成熟的高效表达系统，表达了众多不同的外源基因。

杆状病毒作为在哺乳动物细胞中表达重组蛋白的基因转移载体具有良好的应用前景。含有在哺乳动物细胞中具有活性的基因表达盒的重组杆状病毒，被称作BacMam病毒，它可有效转导多种哺乳动物细胞。BacMam病毒作为基因转移载体转导哺乳动物细胞首先在肝脏细胞中证实。Hofmann等和Boyce等分别用含有细胞巨化病毒（CMV）启动子-荧光酶基因或Rous肉瘤病毒（RSV）的LTR启动子-β-gal基因的重组病毒转导原代肝细胞和多种非肝细胞细胞系，结果表明，在肝细胞和肝瘤细胞中，可观察到有效转导和高水平的报告基因活性。随后大量实验证实，许多细胞系和原代培养细胞都能被BacMam病毒有效转导。BacMam病毒作为基因转移载体的一个优势就是在不同细胞系中直接添加病毒即可，然而有些细胞在良好的转导条件下转导效率并不高。有些研发现，丁酸盐（组蛋白脱乙酰化酶抑制剂）在许多细胞中都有助于提高BacMam病毒介导的基因表达。丁酸盐添加入中华仓鼠卵巢（CHO）细胞悬浮培养液中，低温(34℃相较于37℃更好)孵育可以提高蛋白的表达。

BacMam病毒作为基因转移载体，具有众多优势：

（1）许多细胞系和原代细胞都能被有效转导，但很少或没有观察到细胞毒性，甚至在高达10,000MOI的条件下也很少看到细胞毒性。用含有CMV启动子和绿色荧光蛋白报告基因（GFP）的杆状病毒进行转导试验表明，许多细胞系和原代培养细胞都能被有效转导，而在几个起源于血细胞器官的细胞系中，例THP-1、U937、K562、Raw2647和P388D细胞有非常低水平的转导。

（2）BacMam病毒不但能够转导体外培养的哺乳动物细胞并介导外源基因的表达，而且能在体内转导一些哺乳动物组织并介导目的基因的表达。