[发明专利]促进间充质干细胞体外增殖及延缓衰老的活性基质胶

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于体外培养，可以延缓间充质干细胞（mesenchymal stemcells，MSCs）的复制性衰老、促进细胞增殖并维持MSCs的“干性”的活性基质胶。

背景技术

间充质干细胞MSCs是来源于中胚层的一类成体干细胞，可从骨髓、脐带、胎盘、肌肉、脂肪等多种组织中分离出来。MSCs具有自我更新以及多向分化的潜能，在体内整个生命周期、以及疾病与创伤条件下参与组织器官的更新与修复。间充质干细胞具有免疫调节特性及分泌丰富的营养因子，且具极低的免疫原性，因此具有广泛的临床应用研究的潜能，已被应用于缺血性心脏病、免疫系统疾病、神经系统疾病、糖尿病、GVHD等临床基础与应用研究。但是，原始存在于骨髓、脂肪的MSCs的数目较少，难以满足临床治疗和研究方面的需求，因此需要在体外对间充质干细胞进行大量扩增。然而，像人体其它体细胞一样，间充质干细胞的体外的扩增培养，由于体外失去体内干细胞生存的微环境，在体外培养中从开始就存在着复制性衰老的特性，使MSCs的分化能力及自我更新能力以及相关的特性随着衰老的逐渐加重而丢失。使得人们很难获得既能满足数量上的需求又保持干细胞的特性的细胞，因此严重制约了间充质干细胞的基础与应用研究。

间充质干细胞在体内能保持自我更新及复制能力是取决于所处的干细胞微环境的缘故。研究表明，干细胞生存的微环境，包含了包括细胞外基质（ECM）成分及众多的细胞因子的适宜调控因素，调节着干细胞的特性包括自我更新及多向分化的能力。因此，人们试图体外模拟体内干细胞微环境解决体外培养扩增存在的复制性衰老的难题。模拟微环境含有的主要成分是胶原蛋白，在一定程度上促进了间充质干细胞的增殖及延缓了衰老的出现。同时使用MSCs特异的ECM，即用来源于骨髓间充质干细胞的ECM为自然的成分模拟体内微环境，在体外明显促进了间充质干细胞的增殖，抵抗复制性衰老的过早出现。体外利用ECM成分模拟体内微环境，在一定程度解决了复制性衰老的问题。但是，由于参与干细胞微环境调控的既有ECM成分又包括了细胞因子成分，是个复杂的有机体，现有的合成的方法很难再现其复制性。利用MSCs的ECM构建的干细胞的微环境，由于MSCs本身存在的衰老的及无法大量制备等缺陷更限制了其大量制备，限制了其在临床及基础研究中的应用。因此，随着MSCs大量的临床及基础研究的开展，亟待解决其在体外培养过程中存在的复制性衰老的的问题。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种能在体外包被培养皿的表面模拟体内微环境，延缓MSCs的衰老的发生、促进MSCs增殖的制品。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种促进间充质干细胞体外增殖及延缓衰老的活性基质胶，其特征在于，其是通过以下方法制得：

（1）将切除的脐带置于保存液内，所述保存液为含100u的青霉素及100μg的链霉素的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液，在4℃下保存直至处理；

（2）在无菌条件下用磷酸盐缓冲液冲洗脐带，以75%乙醇浸泡20秒，取出后分解成小段，去除血管及外膜，剪碎至呈0.5-1.5mm³的小块；

（3）转移至无菌离心管中，加入等体积的磷酸盐缓冲液置4℃下48小时，间或震荡，溶胀组织；

（4）用高速匀浆机4℃下匀浆打碎，再用玻璃匀浆器4℃匀浆后，再次用高速匀浆机4℃下尽量将匀浆打碎；

（5）以12000转离心30分钟，取上清，即得到所述活性基质胶成品。

如上所述的活性基质胶，优选地，步骤（1）中，所述脐带在4℃下保存不超过24小时。

如上所述的活性基质胶，优选地，步骤（2）中，所述用磷酸盐缓冲液冲洗脐带为冲洗3次。

如上所述的活性基质胶在促进间充质干细胞体外增殖及延缓衰老中的用途，其特征性在于，所述的用途是将来源于动物或人体的间充质干细胞体外培养于所述活性基质胶，从而促进间充质干细胞体外增殖及延缓其复制性衰老。

如上所述的用途，优选地，将所述活性基质胶以磷酸盐缓冲液0.05-10%g/mL的浓度，于培养容器中37℃下包被2小时，或4℃下包被16-24小时后，用于所述间充质干细胞的体外培养。

一种促进间充质干细胞体外增殖及延缓衰老的活性基质胶的制备方法，其特征在于，所述制备方法的步骤如下：

（1）将切除的脐带置于保存液内，所述保存液为含100u的青霉素及100μg的链霉素的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液，在4℃下保存直至处理；