[发明专利]一种定量检测TRECs和KRECs基因的实时荧光定量PCR试剂盒以及应用

说明书

技术领域

本发明属于体外核酸诊断领域，涉及一种定量检测游离T细胞受体切除环（T-cell receptor excision circles，TRECs）和κ-删除重组切除环（κ-deleting recombination excision circles，KRECs）基因的实时荧光定量聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）试剂盒及其应用。

背景技术

原发性免疫缺陷病（Primary Immunodeficiency Disease，PID）是因免疫系统遗传缺陷或先天发育不全造成免疫功能障碍所致的免疫缺陷病，其总发病率为：美国1/10000，澳大利亚2.82/100000人，日本和瑞典1/5000人，我国香港地区1/8000人。国内缺乏全面的统计资料，如果按照1/10000的发病率，我国每年出生的2500万个新生儿中有2500个新发的PID病例，整个儿童期累计患者达到3万-6万例。原发性免疫缺陷病，与遗传相关，常发生在婴幼儿，可出现反复感染，严重的可威胁生命。因其中有些可能获得有效的治疗，因此及时诊断仍很重要。

2001年11月，美国疾病控制和预防中心（Centers for DiseaseControl and Prevention,CDC）在乔治亚洲首府亚特兰大召开专题研讨会，建立针对新生儿筛查（Newborn Screening,NBS）实验和早期识别PID的方案，以便能早期诊断和治疗PID患者。2009年美国CDC在美国维斯康星州进行重症联合免疫缺陷（Severe CombinedImmunodefieieney Disease，SCID）新生儿筛查。

按免疫缺陷性质的不同，原发性免疫缺陷病可分为体液免疫缺陷为主（即抗体缺乏为主的免疫缺陷）、细胞免疫缺陷为主以及两者兼有的联合性免疫缺陷三大类。此外，补体缺陷、吞噬细胞缺陷等非特异性免疫缺陷也属于本组。重症联合免疫缺陷病是以T淋巴细胞缺乏或功能异常，伴或不伴有B淋巴细胞和NK细胞数量减少或功能缺陷为特征的一组疾病，新生儿发病率大约在1/50000至1/100000，该病发病年龄早，临床表现重，预后较差，如果没有得到及时的诊断和治疗，多在2岁内死亡。SCID是一种严重的联合免疫缺陷，患儿如果不进行有效的免疫重建，往往在婴儿期死亡，免疫重建的时间与预后的关系密切，如果在出生3个月内进行造血干细胞移植存活率接近95%，而3个月后进行造血干细胞移植存活率降至76%，因此将SCID纳入新生儿筛查非常必要。

目前SCID主要分为T-B+SCID和T-B-SCID两大类，其中T-B+SCID的致病原因有γc基因缺陷、Janus Kinase 3（JAK3）基因缺陷、IL-7Rα基因缺陷、CD45基因缺陷、CD3δ/CD3ε/CD3ζ基因缺陷；T-B-SCID的致病原因有RAG1/2基因缺陷、DCLRE1C基因缺陷、ADA基因缺陷、DNA PKcs基因缺陷、网状组织发育不全。除此以外，SCID还包括Oemnn综合征、DNA连接酶Ⅵ、Cemunnos/XLF缺陷、CD40配体缺陷、CD40缺陷、嘌呤核苷磷酸化酶（PNP）缺陷、CD3γ缺陷、CD8缺陷、ZAP-70缺陷、MHC Ⅰ类分子缺陷、MHC Ⅱ类分子缺陷、钙离子通道缺陷等。导致SCID的原因繁多，诊断非常困难，但是所有SCID的共同特征是成熟T细胞的数量显著降低。

T细胞在胸腺中分化的过程是发生在T细胞受体基因的重排的时候，最终是V、D和J基因片段的结合；在每个V、D和J基因片段重排的过程中，都会有被切除的环状DNA产物，被切割下来的DNA形成游离T细胞受体切除环（T-cell receptor excision circles，TRECs），70%表达αβTCRs的T细胞在成熟晚期都产生TREC。TRECs在T细胞中非常稳定，并不随着细胞的增殖而增加，而是不断被稀释，新生儿TRECs的水平最高，但在出生后5年TRECs的水平明显降低。利用定量PCR检测δRec-ψJα TRECs可以反映外周血最新产生的T淋巴细胞数量，病人T细胞中TRECs缺乏或不同程度的减少，可以作为SCID的筛查方法，筛查出T细胞成熟缺陷的新生儿，有利于早诊断早治疗，减少新生儿死亡。