[发明专利]糖类抗原50磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及免疫分析医学领域，具体的，本发明提供了一种糖类抗原50（CA50）磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法。

背景技术

癌症亦称恶性肿瘤，是严重威胁人类健康的一种疾病，据统计，我国每年新患癌症的病人约160万人，每年因癌症死亡的人数约130万人，按目前的医疗水平，早期癌症病人约有80%～90%可以治愈，大大降低了癌症病人的死亡率，可见癌症病人的早期发现、早期诊断和早期治疗尤为重要。

糖类抗原50（CA50）是一种非特异性的广谱肿瘤标志物，以唾液蛋白和唾液酸糖脂为主要成分的一种神经节苷脂抗原，1983年Lindholm等应用结肠癌细胞为免疫原首次制备出CA50单克隆抗体。CA50以脂或脂蛋白结合的形式存在于细胞膜，在正常组织中一般不存在，当细胞恶变时，糖基化酶被激活，造成细胞表面糖基结构改变而成为CA50标志物。CA50对多种上皮类恶性肿瘤有较高的阳性检出率，一般在消化道肿瘤的病人中可以观察到血清中CA50含量升高，与CEA、CA125、CA199等标志物联检，可为疾病的前期筛查、辅助诊断、鉴别诊断、疗效观察、癌细胞转移以及预后提供有参考价值的依据。

在临床上，正常人的血中CA50含量＜20μg/L，许多恶性肿瘤患者血中皆可升高，如66.6％的肺癌、88.2％的肝癌、68.9％的胃癌、88.5％的卵巢或子宫颈癌、94.4％胰或胆管癌，其他如直肠癌、膀脏癌等皆有70％以上是升高的，另外，溃疡性结肠炎、肝硬化、黑色素瘤、淋巴瘤，自身免疫性疾病等也有CA50升高现象。

目前常用的检测CA50的方法有放射免疫分析技术（RIA）和酶联免疫分析法（ELISA），但是这两种方法存在诸多不足，例如RIA存在放射性污染、标记物半衰期短、对操作者具有放射性损伤，且操作繁琐，时间长等缺点；而ELISA灵敏度低，检测范围窄；随着标记免疫技术的迅速发展，各种新的检测方法层出不穷，其中化学发光免疫分析（CLIA）是将化学发光和酶免疫分析结合在此技术上发展起来的，是当今最为敏感的微量免疫测定法。

发明内容

本发明要解决的问题是提供CA50的化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法，避免了放射性免疫分析的试剂有效期短、存在放射性污染、操作繁琐等缺点，且解决了灵敏度低，检测范围窄，成本高的缺陷。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：糖类抗原50磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒，包括：糖类抗原50校准品，浓度为0、5、10、25、50、100KU/mL，校准品稀释液为50%牛血清；偶联有链霉亲和素的磁微粒悬浮液；生物素标记的糖类抗原50抗体；糖类抗原50抗体酶结合物，所用的酶为辣根过氧化物酶，辣根过氧化物酶纯度RZ≥3.0，活性≥250U/mL；糖类抗原50质控品；化学发光液A液和B液；20倍浓缩洗液；反应管。

进一步，所述的发光液A液的主要成分为鲁米诺，B液的主要成分是过氧化脲。A液为0.7g/L鲁米诺，0.165g/L对碘酚，缓冲液为pH8.6的5mmol/L Tris·HCl，避光保存；B液为0.675g/L过氧化脲，用工艺用水配制。

进一步，所述的磁微粒是表面包裹带有氨基或羧基活性基团的四氧化三铁，粒径1～2um。

进一步，所述的糖类抗原50质控品包括低值质控品和高值质控品。

进一步，所述的反应管的材料是透明聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯或玻璃。

试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

（1）糖类抗原50校准品的配制：

将CA50纯品用50%牛血清溶液稀释成系列梯度，浓度分别为0、5、10、25、50、100KU/mL。

（2）糖类抗原50质控品的配制：

将糖类抗原50用含有50%牛血清溶液稀释配制低值质控品高值质控品，低值质控品（QcL）和高质质控品（QcH）的允许范围分别为8～12KU/mL和29.6～44.4KU/mL。

（3）磁性颗粒-链霉亲和素悬浮液的制备：

取100mL0.1mol/L 2-吗啉乙磺酸溶液（MES溶液），依次加入10mg磁性颗粒和3mg链酶亲和素（SA），搅拌30min，然后加入10mg/mL碳二亚胺盐酸盐溶液（1-乙基-(3-二甲基氨基丙基，EDC)3.5uL，反应1h后，使用磁力架吸附，静止10min，移去液体，加入10mL 0.01mol/L PBS，重复上述过程，共洗涤3次，最后用0.01mol/L PBS定溶至1L即可。

（4）生物素标记的CA50抗体的制备