[发明专利]一种测定蝙蝠蛾被毛孢菌丝体粉中虫草素、腺苷、甘露醇的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种测定蝙蝠蛾被毛孢菌丝体粉中虫草素、腺苷、甘露醇的方法，特别是利用高效液相色谱质谱联用仪同时测定蝙蝠蛾被毛孢菌丝体粉中虫草素、腺苷、甘露醇含量的方法。

背景技术

冬虫夏草是一种寄生真菌，学名为蝙蝠蛾被毛孢，寄生于生长在高海拔的对鳞翅目的幼虫，在中国已被作为食品和草药用于治疗各种疾病。它不仅可以作为一种珍贵的药物，用来治疗许多疾病，如咳嗽、肺和肾脏的功能紊乱，据最近的报道，还可作为一种抗衰老的保健滋补食品。冬虫夏草被证明含有虫草素、腺苷、甘露醇、肌苷、腺嘌呤、虫草素多糖等主要生物活性成分，具有抗氧化、增强免疫力和调节人体内分泌系统的功效，特别是其中三个最重要的活性成分：虫草素、腺苷、甘露醇，可视为冬虫夏草的质量评价的指标。

许多研究报道指出，人工的虫草菌丝也具有相似的化学成分、药理作用和临床疗效，能够替代天然的冬虫夏草，而且一些不法商贩将一些替代品如蛹虫草和添加剂进行销售，使市场鱼龙混杂，使人们的身体健康及生命财产受到了伤害，因此,虫草及其产品的质量控制是非常重要的，急需一些快速、有效的检测方法来确保其安全和功效。

目前腺苷成分含量是利用薄层色谱法、高效液相色谱和毛细管电泳来检测的，但灵敏度低、选择性差和耗用时间长。甘露醇的定量方法主要报道如氧化还原法、高效液相色谱、气相色谱、薄层色谱扫描等。黄光裕等曾采用LC/ESI-MS法，以2-氯腺苷为内标物来测量冬虫夏草中腺苷的含量（Huang LF, Liang YZ, Guo FQ, Zhou ZF, Cheng BM. Simultaneous separation and determination of active components in Cordyceps sinensis and Cordyceps militarris by LC/ESI-MS. J Pharm Biomed Anal 2003 Dec 4;33(5):1155-62.），但此种方法一次只能测量一种组分，不能同时检测虫草素、腺苷、甘露醇，并且耗时长，灵敏度不高。

发明内容

为克服上述方法的不足，本发明提供了一种用高效液相色谱质谱联用仪同时测定蝙蝠蛾被毛孢菌丝体粉中虫草素、腺苷、甘露醇含量的方法，与以上方法相比具有分离能力强、定性分析结果准确、检测限低、分析时间快等优点。

所采用的技术方案如下：

本发明提供了一种利用高效液相色谱—质谱联用仪快速、同时测定蝙蝠蛾被毛孢菌丝体粉中虫草素、腺苷、甘露醇的方法，包括以下步骤：

（一）样品处理

精确称取冬虫夏草样本的菌丝体粉0.50 g，均匀研磨和混合，在10ml容量瓶瓶中用超纯水定容，水浴超声提取30分钟，然后用0.45μm过滤膜过滤，所得滤液用高效液相色谱—质谱联用仪进行测定；

（二）高效液相色谱—质谱联用仪的测定条件

（1）    液相条件：色谱柱为Thermo BioBasic-18 PIONEER（150 mm × 2.1 mm, i.d. 5 μm）；柱温为30℃，进样量为5μl；流动相为0.05 mol/L甲酸-甲醇混合溶液(94:6, v/v)，流速为0.2 ml/min；

（2）  质谱条件：离子源为电喷雾离子源（ESI），虫草素、腺苷采用正电离模式,甘露醇采用负电离模式;保护气体为氮气，流速为40 A.U.;辅助气体为氦气，流速为5 A.U.；毛细管温度为350℃,喷雾电压为4.0 kV,毛细管电压是28 V；ESI接口和质谱参数进行优化,以达到最佳；选择性离子检测模式（SIM）进行质谱采集；

（三）绘制标准曲线

分别称取标准品腺苷、虫草素、甘露醇适量，用超纯水溶解使腺苷、虫草素浓度为100mg/L,甘露醇浓度为500mg/L,作为贮备液；然后分别适量储备液，用纯水稀释，依次配置腺苷和虫草素浓度均为10.0 mg/L、20.0 mg/L、30.0 mg/L、40.0 mg/L、50.0 mg/L,甘露醇浓度为100.0 mg/L、200.0 mg/L、300.0 mg/L、400.0 mg/L、500.0 mg/L的混合标准工作液，将混合标准工作液进样10ul在所述色谱和质谱条件下进行测定，以各组分的峰面积对浓度作回归分析，得到峰面积-浓度标准曲线；

（四）数据的分析