[发明专利]GS-DHFRmut双基因筛选表达载体、制备方法及应用

权利要求书

1.一种GS-DHFR^mut双标记基因的真核表达载体，其特征在于含有控制谷氨酰胺合成酶基因表达的启动子及谷氨酰胺合成酶基因，以及控制突变的二氢叶酸还原酶基因表达的启动子及突变的二氢叶酸还原酶基因，两个筛选基因下游均带有PolyA信号序列。

2.根据权利要求1所述的真核表达载体，其特征在于其所述的突变的二氢叶酸还原酶基因具有序列1所示的核苷酸序列。

3.根据权利要求1所述的真核表达载体，其特征在于用于构建所述表达载体的载体骨架为pEE12.4。

4.根据权利要求1所述的真核表达载体，其特征在于所述的控制谷氨酰胺合成酶基因表达和控制突变的二氢叶酸还原酶基因表达的启动子为SV40启动子。

5.权利要求1到4任一所述的表达载体的制备方法，包含以下步骤：将突变的二氢叶酸还原酶基因插入在pEE12.4的MluI位点，或是其他位于GS基因下游序列中的限制性内切酶位点，其中二氢叶酸还原酶基因上游有SV40启动子，下游有SV40-PolyA信号序列。

6.权利要求1到5任一所述的真核表达载体的应用，所述的表达载体用于单个外源基因或多个外源基因的表达。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述的用于单个外源基因表达的步骤为：在外源基因插入位点插入目的外源基因，然后转入宿主细胞得到转化细胞；在基础培养基中添加叶酸类似物甲喋呤和谷氨酰胺合成酶抑制物对转化细胞进行加压筛选已获得高表达细胞株；对获得的高表达细胞株进行扩大培养，最后分离提取目的外源基因的表达产物。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述的用于多个外源基因表达的步骤为：在外源基因插入位点插入目的外源基因一，然后在所述多克隆位点插入目的外源基因二，或是目的外源基因二和三的表达元件，构建双标记筛选多基因表达载体；所述的外源基因二或三的表达元件包括控制目的基因转录的启动子、目的基因序列、以及PolyA终止信号；所述表达载体转入宿主细胞得到转化细胞；在基础培养基中添加叶酸类似物甲喋呤和谷氨酰胺合成酶抑制物对转化细胞进行加压筛选已获得高表达细胞株；对获得的高表达细胞株进行扩大培养，最后分离提取目的外源基因的表达产物。

9.根据权利要求7或8所述的应用，所述宿主细胞为哺乳动物细胞。

10.根据权利要求9所述的应用，所述哺乳动物细胞为非DHFR缺陷型的宿主细胞。

11.根据权利要求10所述的应用，所述哺乳动物细胞为CHO K1细胞。