[发明专利]GS-DHFRmut双基因筛选表达载体、制备方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种真核表达载体、制备方法及应用，具体是GS-DHFR^mut双基因筛选表达载体及其制备与应用，属于生物技术领域。 

背景技术

目前以哺乳动物细胞株为代表的真核表达系统的研发是生物制药发展的趋势。哺乳动物细胞表达系统由于具有精确的转录后加工，翻译及修饰(糖基化、酰胺化、磷酸化及二硫键的形成等)，同时外源蛋白的表达水平是细胞工程发展的重要因素。外源基因的扩增是提高外源蛋白表达水平的重要策略之一。目前为止，广泛应用于工业的基因扩增系统有GS(谷氨酰胺合成酶)基因扩增系统和DHFR(二氢叶酸还原酶)基因扩增系统。 

GS基因扩增系统是利用谷氨酰胺合成酶抑制物(Methioninesulphoximine，MSX)在没有谷氨酰胺的培养条件下使GS基因及与之相连的外源基因扩增，达到提高外源蛋白表达水平的目的。(Bebbiington CR，RennerG，Thomson S et al.Biotechnology，1992；10(2)；169-175.)。DHFR基因扩增系统通过选择DHFR缺陷型的CHO细胞株作为宿主细胞，转染DHFR标记的表达载体到DHFR-细胞株中，通过不断提高MTX的浓度来筛选高表达克隆细胞株。已有文章指出，用不同MTX加压筛选，表达载体内的DHRF标记基因4下游定位的基因同时扩增(Kaufman et al.Mol Cell Biol.1985；5(7)；1750-1759)。此外也有报道，分离到突变的高表达DHFR基因可以在非DHFR缺陷型的宿主细胞中作标记筛选基因，用DHFR^mut基因在CHOK1细胞株中表达，通过不同浓度的MTX加压筛选来提高外源蛋白的表达水平(Christian C，Renner G，Arthur D et al.Biochemistry，1983；80(12)；2495-2499.)。 

然而这种筛选系统要求使用特殊的基因缺陷型细胞，具有一定的局限性。Levinson小组的科学家(Christlan C，Renner G，Arthur D et al.Biochemistry，1983；80(12)；2495-2499.)自小鼠细胞库中分离筛选到了一种突变的DHFR蛋白，DHFRmut。该蛋白位于其活性抑制位点处的第22位氨基酸由野生型的亮氨酸突变为精氨酸，从而大大降低了其与抑制毒素MTX的结合力。这一突变一方面保留了DHFRmut正常的酶活，另一方面则将DHFRmut对MTX的抗性提高了约两个数量级。Levinson小组还进一步考察了DHFRmut重组基因转染DHFR缺失型细胞后的表现，并就其对MTX的耐受浓度与DHFR+细胞株(如CHO-K1细胞株)进行比较，发现DHFRmut不但可以挽救DHFR缺失型细胞的MTX敏感现象，更能将其对MTX的耐受浓度进一步提高，甚至比带有野生型DHFR基因的细胞还要高出2个数量级。这一结果为随后利用该突变的DHFR在非DHFR缺陷型的宿主细胞中使用DHFR外源基因扩增系统提供了思路。在如CHO-K1等非DHFR缺陷型的宿主细胞中，以DHFR^mut基因作为标记筛选基因，，通过不同浓度的MTX加压筛选来提高外源蛋白的表达水平。这一应用将大大扩大DHFR筛选系统使用宿主细胞株的范围。 

发明内容

本发明公开了一种GS-DHFR^mut双标记基因表达载体的表达系统，这个基因扩增表达系统集合了GS系统和DHFR^mut系统两个筛选系统的优点，也克服了DHFR系统要求DHFR缺陷型细胞做转染的缺点。同时应用GS-DHFR^mut双标记基因表达载体的表达系统比单独用GS表达系统的外源蛋白表达水平提高了50～100倍。 

一种GS-DHFR^mut双标记基因的真核表达载体，其特征在于，含有外源基因启动子，5’-UTR序列，外源基因插入位点，PolyA外源基因表达终止信号，控制的谷氨酰胺合成酶基因表达的启动子及谷氨酰胺合成酶基因本身，以及控制的突变的二氢叶酸还原酶基因表达的启动子及突变的二氢叶酸还原酶基因本身。两个筛选基因下游均带有PolyA信号序列。所述的GS-DHFR^mut双标记基因的真核表达载体，具体的突变的二氢叶酸还原酶基因具有Seq ID No.1所示的核苷酸序列。