[发明专利]利用大肠杆菌制备FGF1全长蛋白的方法

权利要求书

1.利用大肠杆菌制备FGF1全长蛋白的方法，包括：

（1）利用PCR方法，从人胎脑的Quick Clone cDNA中扩增人FGF1的全编码序列，扩增后得到目的片段大小为468bp，用琼脂糖凝胶电泳回收PCR产物；

（2）将上述PCR产物用内切酶酶切，得到N端有BamHⅠ、C端有HindⅢ粘性末端的酶切片段，回收后将该酶切片段连接至BamHⅠ和Hind Ⅲ消化好的pMAL-p5X表达载体；

（3）将上述连接产物转化至大肠杆菌DH5a，经培养抽提、测序、分析后，得到测序正确的人FGF1全长cDNA序列的重组质粒；

（4）将测序正确的重组质粒转化至大肠杆菌 BL21，进行培养、诱导表达后离心、洗涤、裂解并收集细菌沉淀；

（5）重悬上述细菌沉淀, 加入MgCl₂溶液，离心得到上清，在上清中加入Tris-Cl后用过滤器过滤、透析，得到含有MBP融合标签的FGF1全长蛋白；

（6）将透析后的液体上到直链淀粉琼脂糖柱上，用洗涤缓冲液冲洗后用洗脱缓冲液洗脱结合的融合蛋白，收集洗脱的蛋白；

（7）将上述收集到的蛋白进行TEV酶切，孵育后将酶切蛋白液又一次上到直链淀粉琼脂糖柱上，收集上样后流出的液体；

（8）将上述上样后流出的液体再次上样于Ni-NTA层析柱，过滤再次上样后流出的液体，得到纯化后的FGF1全长蛋白。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（3）的连接产物转化至大肠杆菌DH5a，平板倒置培养16h后，挑取单克隆培养；质粒抽提后，用BamHⅠ进行克隆鉴定，酶切鉴定正确的克隆进行sanger法测序，得到测序正确的重组质粒。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（4）是在37℃培养4h后进行诱导表达。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述诱导表达是在OD500为0.6、IPTG 为1mM的条件下进行。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述诱导表达后进行离心，将细菌沉淀重悬于细胞洗涤缓冲液中，在4℃、5500rpm条件下离心；再将沉淀重悬于细胞裂解液中，加入PMSF进行室温搅动,于4℃以12000rpm离心后，收集细菌沉淀。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（5）在重悬收集的细菌沉淀时, 加入4℃预冷的MgCl₂溶液，并在4℃条件下搅动，然后以12000rpm 离心，在离心得到的上清中加入Tris-Cl (pH7.1)至pH达到7.1，上清用过滤器过滤后，在4℃的条件下透析，得到含有MBP融合标签的FGF1全长蛋白。