[发明专利]利用大肠杆菌制备FGF1全长蛋白的方法

说明书

技术领域

本发明涉及重组人酸性成纤维细胞生长因子（FGF1），具体是利用大肠杆菌制备FGF1全长蛋白的方法。

背景技术

人酸性成纤维生长因子（FGF1）是已知FGF家族中的成员，为中胚层和神经外胚层来源的有丝分裂原，具有促进血管生成、神经元再生和存活、骨或软骨组织修复及成肌细胞分化等多种生物学功能。一般来说，FGF1的化学特征是可与肝素紧密结合，其等电点呈酸性。已知肝素可通过几种方式调节FGF分子的功能，例如肝素或肝素样分子可直接作用于FGF，激活或增强FGF1的活性。另外，发现可溶性肝素的增效作用似乎对FGF1有选择性，同时，肝素样物质也是FGF特别是FGF1的优选稳定剂。

FGF 1的独特的血管成活性和细胞增殖活性使之特别适用于促进组织特别是深部伤口的愈合。FGF1也在待治疗的损伤部位，特别是在大部分处于酸性环境的损伤部位，FGF1可发挥其温和而持久的生物学活性，从而有利于其在临床上的应用。目前存在多种以重组DNA技术生产FGF1的方法，如一些已构建了很多改良的重组表达系统，还有一些具有提高生物学活性和稳定性的FGF 1类似物或突变体，但整合形式的全长度FGF1的活性要比去除了N末端部分氨基的其他形式的FGF1的活性高，且这些现有技术的FGF1蛋白有些含有融合标签，可溶性不高，产品纯度也较低。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种不含有融合标签，可溶性较高，产品纯度较高的利用大肠杆菌制备FGF1全长蛋白的方法。

本发明解决上述技术问题采用的技术方案为：利用大肠杆菌制备FGF1全长蛋白的方法，包括：

（1）利用PCR方法，从人胎脑的Quick Clone cDNA中扩增人FGF1的全编码序列，扩增后得到目的片段大小为468bp，用琼脂糖凝胶电泳回收PCR产物；

（2）将上述PCR产物用内切酶酶切，得到N端有BamH Ⅰ、C端有HindⅢ粘性末端的酶切片段，回收后将该酶切片段连接至BamH Ⅰ和Hind Ⅲ消化好的pMAL-p5X表达载体；

（3）将上述连产物转化至大肠杆菌DH5a，经培养抽提、测序、分析后，得到测序正确的人FGF1全长cDNA序列的重组质粒；

（4）将测序正确的重组质粒转化至大肠杆菌BL21，进行培养、诱导表达后离心、洗涤、裂解并收集细菌沉淀；

（5）重悬上述细菌沉淀,加入MgCl₂溶液，离心得到上清，在上清中加入Tris-Cl后用过滤器过滤、透析，得到含有MBP融合标签的FGF1全长蛋白；

（6）将透析后的液体上到直链淀粉琼脂糖柱上，用洗涤缓冲液冲洗后用洗脱缓冲液洗脱结合的融合蛋白，收集洗脱的蛋白；

（7）将上述收集到的蛋白进行TEV酶切，孵育后将酶切蛋白液又一次上到直链淀粉琼脂糖柱上，收集上样后流出的液体；

（8）将上述上样后流出的液体再次上样于Ni-NTA层析柱，过滤再次上样后流出的液体，得到纯化后的FGF1全长蛋白。

作为优选，步骤（3）的连接产物转化至大肠杆菌DH5a，平板倒置培养16h后，挑取单克隆培养；质粒抽提后，用BamH Ⅰ进行克隆鉴定，酶切鉴定正确的克隆进行sanger法测序，得到测序正确的重组质粒。

作为优选，步骤（4）是在37℃培养4h后进行诱导表达。

作为优选，所述诱导表达是在OD500为0.6、IPTG为1mM的条件下进行。

作为优选，所述诱导表达后进行离心，将细菌沉淀重悬于细胞洗涤缓冲液中，在4℃、5500rpm条件下离心；再将沉淀重悬于细胞裂解液中，加入PMSF室温搅动，于4℃以12000rpm离心后,收集细菌沉淀。

作为优选，步骤（5）在重悬收集的细菌沉淀时,加入4℃预冷的MgCl₂溶液，4℃搅动，12000rpm离心，在离心得到的上清中加入Tri s-Cl(pH7.1)至pH达到7.1，上清用过滤器过滤后，在4℃的条件下透析，得到含有MBP融合标签的FGF1全长蛋白。

从以上技术方案可知，本发明将人酸性成纤维细胞生长因子全长基因克隆至pMAL-p5X表达载体上，重组质粒在大肠杆菌中高效表达含有MBP融合标签的FGF1全长蛋白，该蛋白为可溶性表达，利用MBP亲和层析柱，将带有MBP融合标签的蛋白纯化出来，再利用TEV酶的结合位点，用TEV消化纯化后的融合蛋白，得到完整的不含融合标签的FGF1蛋白，不仅可溶性较高，而且产品纯度较高。

附图说明