[发明专利]一株重组大肠杆菌及用其制备溶血性磷脂酶C的方法

权利要求书

1.一株重组大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）/pET-plcH，保藏编号为CCTCC No.M 2012425。

2.根据权利要求1所述重组大肠杆菌BL21（DE3）/pET-plcH，CCTCC No.M2012425，其特征在于由下述方法制得：

（1）以保藏编号为CGMCC No.1.205的铜绿假单胞菌（P.aeruginosa）的基因组为模板，克隆得到溶血性磷脂酶C基因，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示；

（2）将步骤（1）所得溶血性磷脂酶C基因克隆到表达载体pET-28a（+）上，得到重组载体；

（3）将步骤（2）所得重组载体转化大肠杆菌感受态细胞，构建得到重组大肠杆菌。

3.用权利要求1～2任一项所述重组大肠杆菌BL21（DE3）/pET-plcH，CCTCCNo.M 2012425制备溶血性磷脂酶C的方法，其特征在于以该重组大肠杆菌为发酵菌株进行液体发酵，制备溶血性磷脂酶C。

4.根据权利要求3所述制备溶血性磷脂酶C的方法，其特征在于具体步骤如下：

（1）种子培养：将所述重组大肠杆菌BL21（DE3）/pET-plcH，CCTCC No.M2012425接种于种子培养基中，于30～37℃振荡培养8～12h，摇床转速150～200r/min；

（2）液体发酵培养：将经过步骤（1）培养所得活化种子液按体积百分比3～10％的接种量接种至发酵培养基，于30～37℃振荡培养4～6h小时，摇床转速150～200r/min；再添加乳糖，于20～30℃振荡诱导培养14～22h，摇床转速150～200r/min；最后添加甘氨酸，于相同条件下继续振荡诱导培养18～36h，发酵完毕，得到发酵液；

（3）粗酶液的提取：将步骤（2）所得发酵液离心；收集上清液，即为胞外粗酶液；收集菌体细胞沉淀并超声破碎，将所得超声破碎液离心，取上清，即为胞内粗酶液。

5.根据权利要求4所述制备溶血性磷脂酶C的方法，其特征在于步骤（1）所述种子培养基成分按克/升计为：蛋白胨9～11g，酵母粉4～6g，NaCl 9～11g，其余成分为水。

6.根据权利要求4所述制备溶血性磷脂酶C的方法，其特征在于步骤（2）所述发酵培养基成分按克/升计为：蛋白胨9～11g，酵母粉5～24g，甘油0～5g，其余成分为0.25mol/L Tris-HCl（pH7.2）。

7.根据权利要求4所述制备溶血性磷脂酶C的方法，其特征在于步骤（2）所述乳糖的添加量为每升所述发酵培养基0.1～5g。

8.根据权利要求4所述制备溶血性磷脂酶C的方法，其特征在于步骤（2）所述甘氨酸的添加量为每升所述发酵培养基0～3g。