[发明专利]一株重组大肠杆菌及用其制备溶血性磷脂酶C的方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程和微生物发酵技术领域，具体涉及一株重组大肠杆菌及用其制备溶血性磷脂酶C的方法。

背景技术

磷脂酶C（PLC），又可称为可定向分解磷脂生成甘油二酯和磷酸单酯，细菌来源的磷脂酶C根据底物特异性的不同主要分为磷脂酰特异性磷脂酶C（PC-PLC）和磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C（PI-PLC）。PLC水解产物甘油二酯是一种生理活性物质，在细胞信号传导途径上起着第二信使的作用，能激活蛋白激酶C（PKC）而引起细胞增殖、分化、收缩、分泌和代谢等功能变化，此外还具有明显的抗血小板粘附、聚集等功能，因此又被称作溶血性磷脂酶C。溶血性PLC对新型抗血小板药物、心脑血管疾病类药物的开发具有一定的潜在价值，对抗静脉血栓及高血压医疗方面的研究意义重大。随着对PLC研究的不断深入及工业发展的需求，PLC的应用价值已经逐渐从药品生产扩展至油脂精炼、磷脂改性、食品加工等领域。例如：在油脂精炼中，利用PLA和PLC混合物进行酶法脱胶，可完全除去磷脂，比水、酸或苛性碱脱胶具有更高的油产率；食品工业中PLC可用来改善在面包在烤制时其表面产生的老化现象，缓和梨皮状表皮。

近年来，随着PLC在食品、医药、饲料等领域的广泛应用，国内外学者对其进行了大量的研究。国外对PLC的研究一直处于领先水平，例如：1982年Vasil等人构建了一株P.aeruginosaPAO2003(pVB81)-CT，其所产溶血性PLC的酶活达到了442.8U/ml（Vasil ML，Berka MR，Gray GL，Nakai H.Cloning of aphosphate-regulated hemolysin gene(phospholipase C)from Pseudomonasaeruginosa.Journal of Bacteriology，1982，152：431-440.）；1990年Ostroff等人将构建的重组质粒pGEM2/PLC-H导入到E.coli BL21（DE3）中，成功得到了一株产溶血性PLC的菌株，该菌株的PLC活性可达到166.7U/ml（Ostroff RM，VasilAI，Vasil ML.Molecular comparison of a nonhemolytic and a hemolyticphospholipase C from Pseudomonas aeruginosa.Journal of Bacteriology，1990，172(10)：5915-5923.)；1997年Cota-Gomez等人成功构建了E.coli BL21（DE3）pGEM-plcHR，该菌株可产溶血性PLC，其酶活达到24.1U/毫克（Cota-Gomez A，Vasil AI，Kadurugamuwa J，Beveridge TJ，Schweizer HP，Vasil ML.PlcR1 and PlcR2are putative calcium-binding proteins required for secretion of the hemolyticphospholipase C of Pseudomonas aeruginosa.Infection and Immunity，1997，65：2904-2913.）。国内对磷脂酶C的研究虽起步较晚，但也取得了一定成果，例如：2005年陈涛等人对筛选到的产PLC菌株Bacillus cereus Shenzhen754-1进行三次紫外线和两次Co60-γ射线诱变处理，筛选出三株高PLC活性的诱变株，酶活分别达到14.878、16.450、16.400U/ml（陈涛，王常高，刘晓辉，何东平.高产磷脂酶C菌株的诱变选育.天然产物研究与开发，2005，17(6)：712-716.）；2007年高林对Bacillus cereus Shenzhen 754-1进行培养条件的优化，将酶活提高至26U/mL（高林.磷脂酶C高产菌株的筛选、鉴定和培养条件的优化研究.安徽农业大学的硕士学位论文，2007.）；2010年詹逸舒筛选到一株Bacillus cereus Z-13，用卵黄琼脂杯碟法测定该菌株所产生的PLC的沉淀圈（乳白色沉淀圈），其直径可达30mm，酶活达到23.31U/ml（詹逸舒.产磷脂酶C菌株的筛选及其酶学性质的研究.湖南农业大学的硕士学位论文，2010.）。